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噬菌体开发的初步步骤......
摘要：p53 基因 (TP53) 替代疗法在癌症基因治疗中显示出良好的效果。然而，它的发展受到了阻碍，主要是因为所选的基因传递载体。CRISPR-Cas9 技术 (成簇的规律间隔的短回文重复序列/CRISPR 相关蛋白 9) 可以敲除突变的 TP53 (mutTP53)，但由于其体积较大，许多病毒载体并不适合或需要实施降低治疗效率的策略。在这里，我们介绍了一种具有靶向癌细胞能力的噬菌体或基于噬菌体的载体，旨在研究使用该载体在人肺腺癌细胞中传递 CRISPR-Cas9 转基因的可行性。首先，我们制作了一种携带 CRISPR-Cas9 转基因盒的肿瘤靶向噬菌体。接下来，我们通过定量聚合酶链式反应 (qPCR) 和菌落形成琼脂平板研究了对载体滴度的任何负面影响。最后，我们结合蛋白质印迹分析和免疫荧光染色来证明体外细胞转导。我们表明，针对肿瘤的噬菌体可以包装包含 CRISPR-Cas9 序列的大型载体基因组 (~10 kb)，而不会对活性或总数的噬菌体颗粒产生任何负面影响。然后，我们以有针对性和有效的方式检测了 Cas9 在人肺腺癌细胞中的表达。最后，我们证明了当 p53 gRNA 被整合到 CRISPR-Cas9 噬菌体 DNA 构建体中时，p53 蛋白表达会丧失。这些概念验证结果支持使用工程噬菌体进行肺癌的 TP53 替代疗法。
噬菌体DNA隔离试剂盒
图1。有效的宿主基因组DNA去除，而无需降低噬菌体DNA产量。 使用Norgen的噬菌体DNA分离试剂盒从四个富集的噬菌体培养物中分离总DNA。 在添加提供的裂解之前，进行了DNase I预处理。 布里液，将20单位的DNase I添加到1 ml富集的噬菌体培养物中，并将混合物在室温下孵育20分钟。 DNAase I处理后，遵循该过程。 作为对照，使用Norgen的噬菌体DNA分离试剂盒从相同4个培养物的等分试样中分离DNA，而无需进行DNase I处理。 进行DNA分析，将10 µL的每50 µL洗脱加载到1x TAE琼脂糖凝胶上。 可以看出，噬菌体DNA被其外套蛋白安全地保护了DNase I治疗，而宿主基因组DNA则被DNase I有效降解。 因此，DNase I预处理导致最终噬菌体洗脱中的宿主GDNA污染较少，而不会影响总噬菌体DNA产量。 车道M是Norgen的Highranger 1 Kb DNA梯子（Cat。 11900）。有效的宿主基因组DNA去除，而无需降低噬菌体DNA产量。使用Norgen的噬菌体DNA分离试剂盒从四个富集的噬菌体培养物中分离总DNA。在添加提供的裂解之前，进行了DNase I预处理。布里液，将20单位的DNase I添加到1 ml富集的噬菌体培养物中，并将混合物在室温下孵育20分钟。DNAase I处理后，遵循该过程。作为对照，使用Norgen的噬菌体DNA分离试剂盒从相同4个培养物的等分试样中分离DNA，而无需进行DNase I处理。进行DNA分析，将10 µL的每50 µL洗脱加载到1x TAE琼脂糖凝胶上。可以看出，噬菌体DNA被其外套蛋白安全地保护了DNase I治疗，而宿主基因组DNA则被DNase I有效降解。因此，DNase I预处理导致最终噬菌体洗脱中的宿主GDNA污染较少，而不会影响总噬菌体DNA产量。车道M是Norgen的Highranger 1 Kb DNA梯子（Cat。11900）。
噬菌体DNA隔离试剂盒
图1。有效的宿主基因组DNA去除，而无需降低噬菌体DNA产量。 使用Norgen的噬菌体DNA分离试剂盒从四个富集的噬菌体培养物中分离总DNA。 在添加提供的裂解之前，进行了DNase I预处理。 布里液，将20单位的DNase I添加到1 ml富集的噬菌体培养物中，并将混合物在室温下孵育20分钟。 DNAase I处理后，遵循该过程。 作为对照，使用Norgen的噬菌体DNA分离试剂盒从相同4个培养物的等分试样中分离DNA，而无需进行DNase I处理。 进行DNA分析，将10 µL的每50 µL洗脱加载到1x TAE琼脂糖凝胶上。 可以看出，噬菌体DNA被其外套蛋白安全地保护了DNase I治疗，而宿主基因组DNA则被DNase I有效降解。 因此，DNase I预处理导致最终噬菌体洗脱中的宿主GDNA污染较少，而不会影响总噬菌体DNA产量。 车道M是Norgen的Highranger 1 Kb DNA梯子（Cat。 11900）。有效的宿主基因组DNA去除，而无需降低噬菌体DNA产量。使用Norgen的噬菌体DNA分离试剂盒从四个富集的噬菌体培养物中分离总DNA。在添加提供的裂解之前，进行了DNase I预处理。布里液，将20单位的DNase I添加到1 ml富集的噬菌体培养物中，并将混合物在室温下孵育20分钟。DNAase I处理后，遵循该过程。作为对照，使用Norgen的噬菌体DNA分离试剂盒从相同4个培养物的等分试样中分离DNA，而无需进行DNase I处理。进行DNA分析，将10 µL的每50 µL洗脱加载到1x TAE琼脂糖凝胶上。可以看出，噬菌体DNA被其外套蛋白安全地保护了DNase I治疗，而宿主基因组DNA则被DNase I有效降解。因此，DNase I预处理导致最终噬菌体洗脱中的宿主GDNA污染较少，而不会影响总噬菌体DNA产量。车道M是Norgen的Highranger 1 Kb DNA梯子（Cat。11900）。
噬菌体DNA分离试剂盒
图 1. 有效去除宿主基因组 DNA，且不降低噬菌体 DNA 产量。使用 Norgen 的噬菌体 DNA 分离试剂盒从四种富集噬菌体培养物中分离总 DNA。在添加提供的裂解缓冲液之前进行 DNase I 预处理。简而言之，将 20 单位 DNase I 添加到 1 mL 富集噬菌体培养物中，并将混合物在室温下孵育 20 分钟。DNAase I 处理后，遵循该程序。作为对照，使用 Norgen 的噬菌体 DNA 分离试剂盒从相同 4 种培养物的等分试样中分离 DNA，而不进行 DNase I 处理。对于 DNA 分析，将每 50 µL 洗脱液中的 10 µL 上样到 1X TAE 琼脂糖凝胶上。可以看出，噬菌体 DNA 被其外壳蛋白安全地保护起来，免受 DNase I 处理的影响，而宿主基因组 DNA 则被 DNase I 有效降解。因此，DNase I 预处理导致最终噬菌体洗脱中宿主 gDNA 污染较少，而不会影响总噬菌体 DNA 产量。M 号泳道为 Norgen 的 Highranger 1 kb DNA Ladder（货号 11900）。