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au：PleaseconfirnheadingLevelsarerePresentedCorrected：CRISPR介导的干扰依赖于指导性CRISPR RNA（CRRNA）和靶核酸之间的互补性，以提供防御噬菌体的防御。噬菌体逃脱了基于CRISPR的免疫力，主要是通过邻接基序（PAM）和种子区域中的突变。然而，包括2类核酸内切酶Cas12a在内的CAS效应子的先前特异性研究表明，单个不匹配的耐受性很高。在噬菌体防御的背景下，尚未对这种不匹配公差的效果进行广泛的研究。在这里，我们测试了针对由Cas12a-CrrNA提供的lambda噬菌体的防御，该噬菌体含有含有先前存在的对基因组DNA中基因组靶标的不匹配。我们发现大多数先前存在的crrna不匹配导致噬菌体逃脱，无论在体外是否不匹配消融cas12a裂解。我们使用高通量测序来检查CRISPR挑战后噬菌体基因组的目标区域。在目标中的所有位置的不匹配均加速了突变噬菌体的出现，其中包括不匹配的不匹配，这些不匹配大大减慢了体外的裂解。出乎意料的是，我们的结果表明，PAM距离区域中存在的错误匹配导致目标的PAM-DISTAL区域中选择突变。体外裂解和噬菌体竞争分析表明，双Pam-Distal错误匹配比种子和Pam-Distal mis-grountes的组合要高得多，从而导致了这种选择。这些结果表明，CAS效应不匹配的耐受性，现有的靶标匹配和裂解位点强烈影响噬菌体的演变。但是，使用CAS9的类似实验并未导致PAM-DISTAL不匹配的出现，这表明切割位置的位置和随后的DNA修复可能会影响目标区域内逃生突变的位置。多种不匹配的CRRNA的表达阻止了新的突变在多个靶向位置产生，从而允许CAS12A不匹配的耐受性提供更强，更长期的protection。
CRISPR-CAS效应子的特异性和裂解位点确定噬菌体逃脱结果
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