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将质粒DNA转换为微圆
在此方案中，我们描述了一种将质粒DNA转化为DNA微圆的新方法，该方法仅由转基因序列组成。这种方法利用了质粒的可伸缩性，同时使用标准分子生物学方法将体外转化率转化为微圆，从而规定了对特殊生产细菌菌株的需求。
复制的合成起源的工程质粒
默认情况下，将RNase H处理的RNA结构折叠为RNA结构，以创建用于DNA聚合酶I（pol I）的底物以启动DNA复制。反义RNA是由重叠基因产生的，如果允许该基因与RNA底漆相互作用，则会诱导不启动DNA复制的替代折叠。由于反义RNA的浓度与质粒副本成正比，因此作为拷贝控制负反馈回路。（b）10
造血干细胞在体内进行双向命运转变。
虽然单克隆抗体（mAb）是一类重要的药品类别，但成本，复杂性，尤其是递送仍然存在重大问题：克服经常注入抗体的概念是一个值得的目标。一种有吸引力的方法是将非整合DNA直接传递给肌肉组织，使患者充当自己所谓的“蛋白质工厂”。使用脂质纳米颗粒（LNP）和病毒载体进行了这种概念的演示，但是这些传递方法面临着重大挑战，包括肝外交付不良，货物兼容性，安全性，可重复性和成本。聚合物纳米颗粒（PNP）提供了解决这些问题的解决方案，但是面临着自己的挑战，例如大量可能的聚合物结构和多体式配方条件。然而，机器学习，材料信息学和高通量化学合成技术的进步为解决这些挑战提供了有效探索聚合物设计空间的基础。我们的Sayer TM平台利用了质粒DNA（PDNA）的大量计算数据集 - 聚合物相互作用来促进靶向剂的发现和通过深度学习的发现，并推动对各种靶向组织的新型PNP的发现。在这项工作中，我们证明了设计PNP的能力，可以为PGT121提供PDNA编码，PGT121是一种广泛中和的抗HIV抗体，该抗体靶向HIV-1 Invelope糖蛋白上的V3 GlyCan依赖性表位位点。Sayer设计的聚合物与PGT121质粒形成小稳定的PNP。此外，我们表明我们可以通过延长来提高抗体水平和耐用性。与其他状态的DNA降低车辆相比，转染后1天，在转染后1天表现出强血清PGT121蛋白水平。更重要的是，纳米PNP的肌内递送启用了大于1.0 µg/ml峰蛋白表达水平，注射后> 56天，有意义的，耐用的表达水平。在肌肉内输送PNP时，可以看到较低剂量和较低的N/P比的一般趋势。这些参数与聚合物结构分开，提供了不同的机制，可以使用机器学习技术优化体内递送性能。可以将概念扩展到其他抗体，蛋白质或酶的连续产生，这表明PDNA通过PNPS作为治疗方式具有广泛的适用性。最后，我们强调，通过安全有效的PNP在体内提供DNA编码的分泌蛋白的策略可能适用于广泛的其他疾病方式。
优化的质粒式骨架可有效RAAV制造
重组腺相关病毒（RAAV）是用于传递遗传信息的最深入研究和最广泛使用的载体之一。但是，将遗传货物向受体细胞有效地转移需要高矢量剂量。质粒DNA（pDNA）是用于制造Raav的关键原料。可以生产的病毒滴度取决于辅助，包装和转移质粒转染的细胞数量以及其生物学活性。因此，对优化质粒的高级疗法需求的开发和应用表现出较高的生物学活性，可以以高质量和数量生产。这些原材料的可用性和负担能力反过来要求高性能生产过程，这些过程的特征是高产品滴度，质粒DNA纯度和可伸缩性。这些特征受到靶质粒的特定序列的影响，尤其是那些对RAAV功能至关重要的序列。Wacker开发了一个专有的饲料批次工艺，该过程最佳地支持了质膜菌株的生长，并允许最佳的质粒复制。此过程允许在高特异性滴度和高纯度下进行可扩展的质粒DNA（包括关键的RAAV制造原材料）的可扩展生产和隔离。使用此过程，我们开发了特定的DNA序列，从而进一步提高了靶质粒的生产率，从而降低了制造成本。并行，我们筛选替代质粒结构，以提高其转染效率和包装细胞系中的生物学活性。结合了由此产生的技术，我们开发了专有质粒，可以进一步促进RAAV制造。具有其生产力，灵活性和可扩展性，Plasmitec®制造平台提供了高质量且负担得起的原材料，因此是开发和应用高级疗法的宝贵促进者。
1 Aavone：用于...
（未通过同行评审认证）是作者/资助者。保留所有权利。未经许可就不允许重复使用。此预印本版的版权持有人于2025年1月8日发布。 https://doi.org/10.1101/2025.01.07.631712 doi：biorxiv Preprint
forprepreptm质粒提取MIDI套件用户手册
7。加入8毫升冰冷的PM3缓冲液，并通过将管反转10到15次中和裂解物，立即混合。（不要涡旋！）- 注：•确保培养细胞的密度最佳，缓冲液体积（PM1，PM2，PM3）应与培养体积成比例地增加。（ex。培养体积，60〜120 ml：PM1，8 ml; PM2，8毫升; PM3，8 ml培养体积，120〜240 ml：PM1，16 ml; PM2，16毫升； PM3，16毫升）•处理120〜240 ml细菌时，需要额外的PM1，PM2和PM3的缓冲液体积时，可以单独购买缓冲液。•确保将细胞颗粒完全悬浮在缓冲液PM1中。•添加缓冲液PM2和缓冲液PM3后，完全混合样品混合物。通过离心8。在4°C下以≥5,000xg的距离离心20分钟。（最好在4°C下以15,000〜20,000 xg离心15分钟）。- 如果上清液仍包含悬浮物，则将上清液转移到干净的离心管上，然后重复此离心步骤。质粒的结合9。将上清液从步骤8传递到平衡的PM MIDI列。让其通过重力流动到PM MIDI柱并丢弃滤液。WASH PM MIDI第10列。通过施加12.5 mL PW缓冲液洗涤PM MIDI柱。允许PW缓冲液通过重力流量流经PM MIDI柱并丢弃滤液。
服务指南全质粒和Amplicon Express ...
整个质粒和Amplicon Express的测序配置为150bp配对的末端。因此，索引ED扩增子的长度应在150-250bp之间（这是靶向扩增子的长度减去NEX TERA标签）。在同一测序运行中具有不同大小的放大器，例如两个极端：150bp和250bp，可能会产生不同数量的测序读数。这是由于较小尺寸群集的扩增子在流动池上更有效地簇，从而导致其在测序池中较高的表示（从而产生更多数据）。AGRF将采用汇总偏移量来解释大小的差异，并最大程度地减少测序读数的可变性。短PCR扩增子不应包含任何内部修饰，荧光团或深色淬火器。服务仅在珀斯可用。4.0样本提交要求
质粒分离与提取 什么是质粒DNA
质粒是一种自主复制的染色体外环状 DNA 分子，不同于正常的染色体 DNA，在非选择性条件下对细胞存活并非必需。细菌质粒是双链 DNA 的闭合环状分子，大小从 1 到 >200 kb 不等。它们存在于多种细菌物种中，在这些细菌物种中，它们表现为独立于细菌染色体遗传和复制的额外遗传单位。质粒通常含有编码酶的基因，这些酶在某些情况下对宿主细胞有利。编码的酶可能与抗生素耐药性、对环境中的毒素（例如复杂的有机化合物）的耐药性或细菌自身产生的毒素有关。质粒一词最早由美国分子生物学家 Joshua Lederberg 于 1952 年提出。同年，J. Lederberg 回顾了细胞遗传方面的文献，并建议将所有染色体外的遗传决定因素称为“质粒”。与细菌染色体相比，质粒的尺寸非常小，较老的质粒仅为大肠杆菌染色体尺寸的 0.8%，尽管存在其他比这个尺寸小的质粒，但 Pl. DNA 和 Ch. DNA 非常相似，环状结构为一个二进制字符串，但在细胞内，与染色体不同，质粒牢固地缠绕在自身周围，形成所谓的超卷曲质粒或共价闭合环状 (CCC)。如果已知质粒的表型标记（例如抗生素抗性），建议在选择压力下培养细胞以避免质粒丢失。
质粒为AMR载体
项目详细信息项目代码MRCIIAR25EX SANDERS标题质粒作为AMR矢量研究主题感染，免疫，抗菌素抵抗和修复摘要抗微生物抗性（AMR）正在升至危险的高水平，从而导致全球健康危机。要制定打击AMR的策略，我们需要知道AMR基因如何扩散。质粒作为无处不在的移动遗传元素是AMR传播的关键参与者。抗生素使携带AMR质粒有益于其细菌宿主，因此驱动质粒患病率和进化。该项目将研究可以在微生物组内和之间传播抗性的高度传播AMR质粒的演变。这将通过使用质粒基因组学和网络分析的针对性实验和对复杂微生物组的研究来完成。描述背景抗生素在临床和农业环境中的广泛使用导致抗生素耐药性的快速发展和传播，导致重大健康危机（1）。细菌可以通过突变或吸收抗药性基因获得对抗生素的抗性（2）。质粒在抗菌耐药性（AMR）基因的扩散中起关键作用（3），因为它们在不同细菌之间转移的能力（4）。质粒相互作用的不同细菌宿主的范围，即质粒通用主义，因此对于AMR的扩散至关重要。有证据表明抗生素可以增强质粒通用性，这不仅可以促进AMR基因在选择下的传播，而且还可以允许其他AMR基因与通用质粒一起搭档（5）。这可能导致多药抗性质粒在微生物群落中的传播，更令人担忧的是，在环境，农业和临床微生物中，这是OneHealth概念中承认的威胁（2）。AMR质粒扩散，当降低抗生素选择时会减少。但是，尚不清楚是否是这种情况。质粒可以迅速发展（6），并且持续暴露于多个宿主可能导致质粒的演变，这些质粒在微生物中传播更为成功（7）。即使是单一抗生素的暴露也可能导致质粒的演变，这些质粒通常是AMR基因的高度感染矢量。该项目旨在确定质粒如何变为可传播的AMR载体。将经过实验测试，与环境相关的抗生素暴露方式如何塑造质粒通用，并确定质粒上的分子/功能变化。该项目将进一步研究AMR质粒在复杂社区（宿主质量网络）和病原体与理论建模相结合的传播。关键问题是进化的质粒通用性，AMR的驱动因素扩散到微生物中的病原体吗？随着质粒通用的增加，我们可以期望宿主质差网络的结构发生重大变化，变得更加互连，质粒在
Plasmid2MC：高效无细胞重组质粒成高纯度微环 DNA 用于基因组编辑应用
DNA 质粒通常用于在基因组编辑中传递蛋白质和 RNA。然而，与缺乏此类细菌序列的微环 DNA (mcDNA) 相比，它们的细菌成分可能导致失活、细胞毒性和效率降低。现有的将质粒重组到专有细菌菌株内的 mcDNA 中的商业试剂盒劳动密集型，产生的结果不一致，并且通常产生低质量的 mcDNA。为了解决这个问题，我们开发了 Plasmid2MC，这是一种使用 Φ C31 重组的无细胞方法，可有效从常规制备的质粒中切除细菌骨架，而 mcDNA 纯化步骤可消化所有 DNA 杂质并降低内毒素水平。我们展示了 mcDNA 表达 CRISPR-dCas9 在 HEK293T 细胞和小鼠胚胎干细胞中的碱基编辑以及同源性独立的靶向插入 (HITI) 基因组编辑中的应用。该方法易于制备、效率高且 mcDNA 纯度高，使其成为需要细菌无骨架环状 DNA 的应用的宝贵替代方案。