NORGEN的纯化技术纯化基于自旋色谱柱色谱法。优先从其他细胞成分(例如基因组DNA和RNA)中纯化质粒DNA。该过程涉及首先颗粒的隔夜细菌培养物具有质粒DNA(请参阅第3页的流程图)。然后,使用提供的重悬溶液AZ重悬细菌颗粒,并使用裂解缓冲液N进行细菌。然后添加缓冲液。然后添加缓冲液TN,从而导致溶液中存在的基因组DNA和蛋白质。然后通过离心阐明裂解物,以去除含有质粒DNA的裂解物中的沉淀蛋白和基因组DNA。然后将澄清的裂解物加载到自旋柱上。Norgen的柱以取决于离子浓度的方式结合DNA,因此,只有质粒DNA才能与柱结合,而大多数消化的RNA和蛋白质将在流动中除去或保留在柱床的顶部。然后用提供的洗涤溶液J洗涤结合的DNA,以去除剩余的杂质。最后,无内毒素纯化的质粒DNA用洗脱缓冲液洗脱。纯化的DNA是最高质量的,可用于许多下游应用,包括测序,克隆和转染。
Northx Biologics提供了一项全面的PDNA服务,从R&D等级到由EMA批准的顶级现代设施生产的GMP质粒。为了确保在阶段之间平稳地传递过程和测试,尽管灵活,但在质量等级之间保持一致。
腺相关病毒(AAV)是基因治疗的强大载体;但是,使用AAV向量可能具有挑战性。每个构建体包含两个反向末端重复(ITR)序列,通常长145 bp,是感兴趣基因的侧面(图1)。ITR形成高度稳定的T形发夹,这对于病毒DNA 1的复制和封装至关重要。这些结构特征也会对传统克隆工作流造成严重破坏。自发缺失转移质粒的鼠疫DNA制剂,以及二级结构的形成确认性测序。因此,研究人员被双重打击:容易截断的AAV矢量,这些突变很难检测到。在这里,我们讨论了传播和验证AAV质粒的挑战,并展示了对工作流程的优化方法。
整个质粒和Amplicon Express的测序配置为150bp配对的末端。因此,索引ED扩增子的长度应在150-250bp之间(这是靶向扩增子的长度减去NEX TERA标签)。在同一测序运行中具有不同大小的放大器,例如两个极端:150bp和250bp,可能会产生不同数量的测序读数。这是由于较小尺寸群集的扩增子在流动池上更有效地簇,从而导致其在测序池中较高的表示(从而产生更多数据)。AGRF将采用汇总偏移量来解释大小的差异,并最大程度地减少测序读数的可变性。短PCR扩增子不应包含任何内部修饰,荧光团或深色淬火器。服务仅在珀斯可用。4.0样本提交要求
NucleOmag®质粒程序利用了修饰的碱性裂解方案,并结合了适当的缓冲条件下核酸对顺磁珠的可逆吸附。颗粒细菌被重悬于缓冲液A1中。质粒DNA通过裂解缓冲液A2从细胞中解放出来,然后使用缓冲液S3进行中和和沉淀。粗裂解物可以通过离心或使用NucleOmag®清除珠(用于裂解液清除的专门的顺磁珠)清除。用于将核酸与顺磁珠,结合缓冲液和核瘤®M珠结合的结合添加到清除的裂解物中。磁分离后,通过获得专利的排毒缓冲液ERB去除内毒素和蛋白质。用洗涤缓冲液和空气干燥除去盐或残留乙醇等进一步的污染物。纯质粒DNA用低盐洗脱缓冲液或水洗脱,并准备好用于任何常见的下游应用(包括转染)(仅研究)。核对®质粒试剂盒已设计用于自动磁杆系统。
双镍酶质粒被视为“许可产品”,应按照www.scbt.com/limitedlicense上规定的有限许可使用。购买此产品向买方购买了不可转让的使用权的产品,以及仅用于购买者在其实验室中进行的研究目的的所有重复和衍生品(无论买方是学术还是营利性实体)。买方不能出售或以其他方式转移(a)本产品(b)使用此产品或其组件制成的材料或(c)将其组件或其组件制成的材料或以其他方式使用本产品,其组件或使用此产品或其组件制造的材料或材料出于商业目的。
质粒DNA的产率和质量受质粒拷贝数,质粒大小,插入毒性,宿主应变,抗生素选择,生长培养基和培养条件的影响。对于大肠杆菌的标准克隆菌株,我们建议使用新鲜条纹的选择板中的单个菌落来接种标准的生长培养基,例如LB(Luria-Bertaini)培养基。培养物通常在37°C和200-250 rpm的血管中生长,该容器允许曝气(Erlenmeyer烧瓶或滚筒上的Erlenmeyer烧瓶或培养管),并在12-16小时后收获,因为培养物从对数生长到固定相的培养过渡。这是质粒DNA含量最高的时间。LB中的培养物通常在3-6之间的最终OD 600中饱和,但生长至饱和度通常会导致细胞裂解。结果,质粒的产量和质量降低,并增加不需要的宿主染色体DNA的可能性增加。使用丰富的培养基(例如2x YT或TB)在较短的时间内会产生更高的生物量。如果选择用于生长,则应对准备中使用的培养时间和细胞数量进行调整以纠正这些差异,并避免矩阵过载并降低DNA的产量和质量。
定期间隔间隔的短篇小学重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CAS9)系统是ARCHEA和细菌用于降解异物(4,6)的适应性免疫反应防御机制(4,6)。该机制可以用于其他功能,包括用于哺乳动物系统的基因组工程,例如基因敲除(KO)(KO)(1,2,3,5)。crispr/cas9 ko质粒产物通过利用从基因组尺度CRISPR敲除(Gecko)V2库中得出的指导RNA(GRNA)序列来鉴定和裂解特定基因,该序列在广泛研究所的张实验室中开发的基因组规模CRISPR敲除(Gecko)V2库(3,5)。
成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 和 CRISPR 相关蛋白 (Cas9) 系统是一种适应性免疫反应防御机制,古细菌和细菌利用该机制降解外来遗传物质 (4,6)。该机制可重新用于其他功能,包括哺乳动物系统的基因组工程,例如基因敲除 (KO) (1,2,3,5)。CRISPR/Cas9 KO 质粒产品利用来自 Broad 研究所张实验室开发的全基因组 CRISPR 敲除 (GeCKO) v2 库的向导 RNA (gRNA) 序列,能够识别和切割特定基因 (3,5)。