核糖核酸酶测定DRR:在37°C下将10 µL DRR与160 ng 2 Kb RNA转录物一起孵育10 µL DRR后,检测到无污染的RNase。对于DNase I:在37°C下以160 ng的2KB RNA转录本与160 ng的2KB RNA转录本孵育5U后,未检测到污染RNase 4小时。
如果所讨论的蛋白质对于病毒的复制或癌细胞的不受控制的生长很重要,则可以观察到治疗作用。从理论上讲,反义寡核苷酸也可用于阻断正常细胞中蛋白质的合成,以便可以确定特定蛋白质的生物学作用。但是,在此应用程序中,最近开发的RNAi方法更受欢迎。RNA:反义寡核苷酸和靶mRNA之间形成的DNA混合双链体直接干扰蛋白质合成,从而降低了编码蛋白的表达。这种抑制作用可能是由于核糖体与反义寡核苷酸结合和/或杂化无法通过核糖体和直接蛋白质表达的核糖体周围组装的抑制作用。核糖核酸酶H(RNase H)对与反义寡核苷酸杂交的mRNA分子的核酸酶H(RNase H)的内核酸酶活性增强了反义作用。rNase h破坏了mRNA链,RNase H酶和反义寡核苷酸在循环结束时保持完整:因此,反义效应是催化的(图1)。单个反义寡核苷酸可以通过该机制销毁许多mRNA分子。酶RNase H发生在正常细胞中,在正常细胞中,它在去除DNA复制滞后的短链中起着重要作用。
无人DNA的不包括人DNA(检测极限:小于2 pg DNA)。如果产品被单个人类细胞(例如皮肤中的细颗粒)污染,则可能导致假阳性结果。 这在诊断和法医医学领域尤其重要。不包括无DNase DNase。 DNase是一种分解DNA的酶。用DNase污染会影响DNA分析。不包括无RNase RNase。 RNase是一种分解RNA的酶,对高压灭菌和辐射具有极大的抗性。 PCR抑制剂(PCR抑制剂)不含它不包含显着损害PCR反应(抑制剂)的物质。重要的是,PCR反应中使用的消耗品不会包含不利影响反应的杂质。 这对于痕量遗传物质的扩增和定量PCR尤为重要。
无人DNA的不包括人DNA(检测极限:小于2 pg DNA)。如果产品被单个人类细胞(例如皮肤中的细颗粒)污染,则可能导致假阳性结果。 这在诊断和法医医学领域尤其重要。不包括无DNase DNase。 DNase是一种分解DNA的酶。用DNase污染会影响DNA分析。不包括无RNase RNase。 RNase是一种分解RNA的酶,对高压灭菌和辐射具有极大的抗性。 PCR抑制剂(PCR抑制剂)不含它不包含显着损害PCR反应(抑制剂)的物质。重要的是,PCR反应中使用的消耗品不会包含不利影响反应的杂质。 这对于痕量遗传物质的扩增和定量PCR尤其重要。
无细胞的生物传感器是医学诊断的有前途的工具,但是它们的性能可能会受到样本本身或外部组件产生的基质效应的影响。在这里,我们使用两个记者系统(SFGFP和荧光素酶)系统地评估血清,血浆,尿液和唾液中无细胞系统的性能和鲁棒性。在所有情况下,临床样品都具有强大的抑制作用。,只有RNase抑制剂减轻基质效应。但是,我们发现RNase抑制剂的恢复潜能因从商业缓冲液中包含的甘油的干扰而部分突出。我们通过设计产生RNase抑制剂蛋白的菌株来解决此问题,不需要额外的提取准备。此外,我们的新提取物比以前的条件和与基质效应相关的脾气暴躁的室内变异性产生的记者水平更高。在许多类型的临床样本中统一的无细胞系统鲁棒性的这种系统评估和改进是朝着各种疾病开发无细胞诊断的重要一步。
准备工作:FRN缓冲液:将42毫升异丙型物添加到新的瓶子RPE缓冲液中:将44 ml EtoH添加到新瓶AW1缓冲液中:向新瓶AW2缓冲液添加25 ml EtoH:添加30 ml EtoH DNase I股票:550 µL无RNase rnase for lyophifiend dnase dnase i,Aliquot and ealiquot and aT -20个月
a. 95% 乙醇(Sigma E7023 或同等溶液) b. 不含 DNase/RNase 的水(Life Technologies AM9937 或同等溶液) c. 去离子水/蒸馏水/Milli-Q 水 d. NaCl(Sigma S3014 或同等溶液) e. NaOH(Sigma S5881 或同等溶液) f. HCl(Sigma H1758 或同等溶液) g. 甘氨酸(Sigma G7126 或同等溶液) h. 10X PBS 组织培养 (tc) 级(Sigma P5493)稀释至 1X i. KCl(Sigma P9541 或同等溶液) j. 磷酸二氢钾(Sigma P9791 或同等溶液) k. 磷酸氢二钠(Sigma S5011 或同等溶液) l. 甘油(Sigma G5516 或同等溶液) m.无 DNase/RNase 微量离心管,不粘连、低吸附、硅化 0.5 ml(Life Technologies AM12350 或同等产品) n. 无 DNase/RNase 微量离心管 1.5 ml,不粘连、低吸附、硅化(Life Technologies AM12450 或同等产品) o. 无 DNase/RNase 微量离心管 2.0 ml,不粘连、低吸附、硅化(Life Technologies AM12475 或同等产品) p. 过滤屏障防气溶胶微量移液器吸头,无 DNase/RNase(0.2 – 1000 µl) q. Qiagen QIAamp 病毒 RNA 小量试剂盒(Qiagen 52904) r. Qiagen 收集管(Qiagen 19201) s. OneStep™ PCR 抑制剂去除试剂盒(Zymo Research D6030) t. 2.0 mL 微量离心管,不含 DNase/RNase(USA Scientific 1620-2799 或同等产品) u. OneStep RT-PCR 试剂盒(Qiagen 210210 或 210212) v. Ambion Superase·In RNase 抑制剂(20 单位/µl);Life Technologies AM2694 (2,500 U) 或 AM2696 (10,000 U) w. Eppendorf DNA LoBind Tubes 5.0 mL Fisher Scientific 0030108310 或同等产品 x. 15 ml 聚丙烯锥形管(Fisher Scientific 14-959-70C 或同等产品) y. 50 mM MgCl 2(BioRad 1708872 或同等产品)或 25 mM MgCl 2(ThermoFisher Scientific AB0359 或同等产品)z.内部对照 RNA(BioGX 目录号 750-0001 - 联系公司)aa. 所有 RTqPCR 检测的标准脱盐引物和 HPLC 探针(Integrated DNA Technologies 或同等公司)bb. RT-qPCR 阳性对照(甲型流感病毒的定量基因组 RNA