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CRISPR介导的转录抑制作用弓形虫Gondii
用于调整内源基因表达的抽象工具是确定各种细胞表型的遗传基础的关键。尽管在弓形虫中可以使用合成的可调节性，但基因表达的靶向和组合下调的可扩展方法（如RNA干扰）尚未得到发展。为了研究CRISPR介导的转录调控的可行性，我们研究了来自甲状腺链球菌和嗜热链球菌的两个催化无活性Cas9（DCAS9）直系同源物的功能。在添加靶向启动子的单个指定RNA（SGRNA）和表面抗原基因SAG1的5 9个未翻译区域（UTR）后，我们对靶基因的蛋白质刺激蛋白质的变化通过流量细胞仪的蛋白质刺激变化，用于转录报告基因和immu-immu-nosu-nosu-noce。我们发现DCAS9直系同源物产生了一系列靶基因表达水平，并且抑制程度持久且稳定地遗传。因此，化脓性链球菌和嗜热链球菌DCAS9可以有效地产生弓形虫中的基因表达水平。两个DCAS9的独特的SGRNA支架要求允许通过转录调制，基于显微镜的研究标记或其他基于DCAS9的方法同时检查两个不同的基因座。利用新近获得的基因组转录起始站点数据，这些工具将有助于开发弓形虫的新功能筛查方法。
开发四链体实时定量RT- ...
猪血凝性脑脊髓炎病毒（PHEV），猪假拟南芥病毒（PRV），经典猪发烧病毒（CSFV）和日本的脑炎病毒（JEV）导致感染猪的神经学症状相似，及其对实验性诊断的差异性诊断。设计了四对特定引物和探针，分别针对PHEV N基因，PRV GB基因，CSFV 5'非翻译区域（5'UTR）和JEV NS1基因，并且开发了四倍的实时定量RT-PCR（QRT-PCR（QRT-PCR），以检测和分化的PHEV，pRV，pRV，pRV，pRV，pRV，＆JEV。该测定显示高灵敏度，每种病原体的检测极限（LOD）为1.5×10 1拷贝/μL。该测定法仅检测到PHEV，PRV，CSFV和JEV，而没有与其他猪病毒交叉反应。测定内和测定间的变异系数（CVS）小于1.84％，可重复性很高。通过已发达的四倍体QRT-PCR测试了总共1,977个临床样本，包括组织样本和从中国广西省收集的全血样本，以及PHEV，PRV，PRV，CSFV和JEV的阳性率为1.57％（31/1,977），0.355％（7/1,1,97）， （21/1,977）和0.10％（2/1,977）。也通过先前报道的QRT-PCR分析测试了这1,977个样品，这些方法的巧合率超过99.90％。发达的测定法被证明是快速，敏感和准确的，用于检测和分化PHEV，PRV，CSFV和JEV。
鸡肉mir-126-5p通过靶向traf3
抽象的先天免疫在防止病原微生物的侵袭中起着至关重要的作用。然而，先天免疫是一把双刃剑，其过度激活对免疫稳态有害，甚至导致受感染宿主的“细胞因子风暴”。宿主开发了一系列负调节机制，以衡量免疫反应。在这里，我们报告了由miRNA介导的鸡肉先天免疫的负调节机制。在GEO数据库中，我们发现MiR-126-5p在感染RNA病毒感染的鸡中明显上调。然后，通过细胞模型和体内检测进一步显示了RNA病毒对miR-126-5p的上调。miR-126-5p的过表达显着抑制了由RNA病毒诱导的干扰素和炎性细胞因子相关基因的表达。miR-126-5p表达敲低后，取得了相反的结果。生物信息学分析确定TRAF3是miR-126-5p的候选靶基因。在实验上，miR-126-5p可以靶向TRAF3，如miR-126-5p对TRAF3内源性表达的影响以及TRAF3 3'UTR驱动的荧光素酶报道器测定法。此外，我们证明了miR-126-5p通过通过共表达测定法阻断MAVS-TRAF3-TBK1轴来负调节的先天免疫性。总体而言，我们的结果表明，miR-126-5p参与了鸡肉先天免疫的负调节，这可能有助于维持免疫平衡。关键字：鸡肉，mir-126-5p，traf3，RNA病毒，先天免疫
suzukii果蝇中的高效诱导型CRISPR-CAS9基因靶向
摘要：斑点的果蝇（果蝇苏木木松木）是东亚的原生，但已成为对水果生产的全球威胁。近年来，在该物种中建立了CRISPR/CAS9靶向，允许进行功能性基因组和遗传控制研究。在这里，我们报告了D. suzukii表达Cas9菌株的产生和表征。使用含有EGFP荧光标记基因的Piggybac构建体生成了五个独立的转基因线，而在D. melanogaster Heat Hote Hote蛋白70启动子和3'UTR的控制下，Cas9基因在CAS9基因下产生。热震（HS）处理的胚胎，揭示了转基因CAS9表达的强热诱导性。通过将靶向EGFP的GRNA注入一条选定的线中，G 0倍的50.0％显示出镶嵌的荧光表型，而G 0倍的G 0倍产生的G 1突变体没有HS。通过应用HS，这种体细胞和种系诱变率分别增加到95.4％和85.7％。接受HS的父母植物导致其后代的突变遗传（92％）。另外，针对内源基因黄色导致色素沉着和男性致死性。我们讨论了这些效率和温度依赖性CAS9菌株的潜在用途用于铃木D. suzukii中的遗传研究。
可编程的哺乳动物翻译调节剂通过CRISPR相关蛋白
摘要合成遗传回路的复杂性依赖于具有高正交性的生物电路的曲目。尽管依赖RNA结合蛋白（RBP）的转录后电路符合曲目的资格，但监管设备的有限库阻碍了网络网络模块化和可扩展性。在这里，我们建议将墨盒（CAS响应转化调节可集成到多样化的基因组工程中）以将CRISPR相关（CAS）蛋白作为转化调节剂重新利用。我们证明了一组CAS蛋白能够抑制（OFF）或激活（ON）5'-UTR中包含CAS结合RNA基序的mRNA翻译。我们设计了81种不同类型的翻译，并在开关上验证了它们的功能特征。其中许多功能充当有效的翻译调节剂，并在哺乳动物细胞中显示正交性。通过互连这些开关，我们设计和构建了人工电路，包括60个翻译和大门。此外，我们表明，可以重新使用各种与CRISPR相关的技术，包括抗Crispr和Split-Cas9平台，以控制翻译。我们的CAS介导的翻译调节与CAS蛋白的转录调节兼容，并增加了元素较少的合成回路的复杂性。弹药筒比以往任何时候都更加构建蛋白质响应的mRNA开关，并导致CAS介导的基因组编辑和翻译调节技术的发展。
原始文章生物信息学分析和热休克蛋白中的替代多腺苷酸化70（HSP70）家庭成员
摘要：目的：热休克蛋白70（HSP70）家族是一组高度保守的分子助力者，对于维持细胞稳态必不可少。这些蛋白质对于蛋白质折叠，组装和降解是必需的，并且涉及从应力条件中恢复细胞。HSP70蛋白质因热休克，氧化应激和致病性感染而上调。他们的主要作用是防止蛋白质聚集，重新折叠错误折叠的蛋白质以及靶向不可损害的蛋白质的降解。鉴于它们参与了基本细胞过程和应激反应，HSP70蛋白对于细胞存活和调节癌症，神经变性和其他病理的疾病结局至关重要。本研究旨在了解各种HSP70成员的主要结构，物理化学特性，磷酸化，泛素化和替代聚腺苷酸化位点预测。方法：SMART和Internoscan软件用于域分析。分别使用Protparam，NetPhos 3.1服务器DTU和Mubisida进行物理化学分析，磷酸化和泛素化站点分析。使用EST数据库研究了替代聚腺苷酸化。结果：域分析表明，某些HSP70成员中存在盘绕圈和核苷酸结合结构域。五个HSP70家庭成员在其3'UTR中具有替代的聚腺苷酸化位点。结论：确定工作为其结构，功能，相互作用组和聚腺苷酸化模式提供了宝贵的见解。研究其在癌症等疾病中的治疗潜力可能会有所帮助。
MicroRNA-15A/16-1功能的丧失促进了实验性创伤性脑损伤的神经病理学和功能恢复
近年来，创伤性脑损伤（TBI）越来越关注年轻人发病率和死亡率的原因（1）。脑创伤的特征是局灶性脑组织机械破坏（主要损伤）和延迟的弥漫性脑损伤（次要损伤）（2）。先前的研究表明，TBI会引起灰质损伤（神经元死亡）和白质损伤以及严重的炎症反应（3-5）。创伤后大脑中原发性和继发性损伤的严重程度决定了长期神经恢复的进展（2）。在脑创伤后，血液脑屏障立即被破坏，外周血免疫细胞（例如嗜中性粒细胞和麦芽脂）会浸润到脑实质中。同时，周围大脑中的星形胶质细胞活化和小胶质细胞极化也得到了增强。这些外周和脑炎症细胞引发了严重的炎症反应，在TBI后加速了白质损伤。因此，必须确定机制并开发有效的治疗方法，以减轻TBI后永久性脑损伤和神经行为功能障碍。microRNA（miRS）是单链非编码RNA，通过将调节基因的3'非翻译区域（3'-UTR）抑制或诱导靶向mRNA降解（6）。每个miR可以负调节多个靶基因的表达，并且每个基因也受大量miR的调节。stud- ies表明，TBI患者的大脑和血浆中有几种miR被显着升高或抑制，因为这些改变的miR是用于诊断和治疗TBI的潜在生物标志物（7）。
2024; 15（12）：3995-4006。 doi：10.7150/jca.90087研究论文miR-497-5p表达和胃癌的生物学活性
背景：这项研究旨在研究miR-497-5p在胃癌（GC）及其可能的机制中的表达和生物学作用。方法：进行实时定量PCR（RT-QPCR），以检测GC和正常组织中的miR-497-5p，以及GC细胞系与正常的胃粘膜细胞（GES-1）（GES-1）。通过计数KIT-8（CCK8）测定和溴化乙锭（EDU）测定法测量了miR-497-5p过表达对增殖的影响。流式细胞仪用于评估细胞周期。分别通过刮擦分析和Transwell分析评估迁移和入侵。MiR-497-5p的基因靶标使用与MirtarPathway数据库结合使用的“ Multimir” R软件包。，然后使用Luciferase Reporter实验来评估GC细胞系中miR-497-5p Mimics的ERBB2活性。此外，还进行了功能实验，以验证miR-497-5p /erbb2对GC细胞表型的影响。结果：与正常组织和粘膜细胞相比，GC组织和GC细胞系中miR-497-5p降低。miR-497-5p显着降低了增殖，迁移和侵袭能力，胃癌细胞的凋亡比升高。生物信息学表明，ERBB2可能是miR-497-5p双酸酶酶报告基因实验的潜在靶标，表明它不良调节的ERBB2 3'UTR荧光素酶活性。与正常组织和细胞相比，GC组织和细胞中ERBB2的表达明显更高。胃癌细胞中ERBB2的过表达显着降低了miR-497-5p对GC细胞恶性行为的抑制作用。结论：MiR-497-5p在GC组织和细胞中显着下调，这通过靶向ERBB2抑制了GC细胞的恶性特征。
ADAR1 编辑组揭示了编辑特异性的驱动因素......
作用于 RNA ADAR1 的腺苷脱氨酶促进双链和结构化 RNA 中的 A 到 I 转换。ADAR1 有两种异构体，它们从不同的启动子转录：细胞质 ADAR1p150 是干扰素诱导的，而 ADAR1p110 是组成性表达的，主要位于细胞核中。ADAR1 突变会导致艾卡迪-戈蒂埃综合征 (AGS)，这是一种与异常 IFN 产生相关的严重自身炎症疾病。在小鼠中，ADAR1 或 p150 异构体的缺失会导致胚胎死亡，这是由干扰素刺激基因的过度表达引起的。这种表型通过删除细胞质 dsRNA 传感器 MDA5 得到挽救，表明 p150 同工型是不可或缺的，不能被 ADAR1p110 挽救。尽管如此，ADAR1p150 唯一针对的编辑位点仍然难以捉摸。在这里，通过将 ADAR1 同工型转染到无 ADAR 的小鼠细胞中，我们检测到了同工型特异性的编辑模式。使用突变的 ADAR 变体，我们测试了细胞内定位和 Z-DNA 结合域的存在如何影响编辑偏好。这些数据表明 ZBD 对 p150 编辑特异性的贡献很小，而同工型特异性编辑主要由 ADAR1 同工型的细胞内定位指导。我们的研究通过对异位表达标记 ADAR1 同工型的人类细胞的 RIP-seq 进行补充。两个数据集均表明 ADAR1p110 富集了内含子编辑和结合，而 ADAR1p150 优先结合和编辑 3'UTR。