XiaoMi-AI文件搜索系统
World File Search Systemnuclease
当前生物信息学工具可优化 CRISPR/Cas9 实验以减少脱靶效应
摘要：CRISPR-Cas 系统已发展成为一种尖端技术，通过精确的基因操作改变了生物科学领域。CRISPR/Cas9 核酸酶正在发展成为一种革命性的方法，可以编辑任何物种的任何基因并获得理想的结果。CRISPR-Cas 技术的快速发展反映在不断扩展的生物信息学工具生态系统中，这些工具旨在使 CRISPR/Cas9 实验更容易。为了帮助研究人员设计出有效的向导 RNA 并减少脱靶效应、选择核酸酶靶位和进行实验验证，生物信息学家已经建立并开发了一套全面的工具。在本文中，我们将回顾可用于评估脱靶效应以及量化核酸酶活性和特异性的各种计算工具，包括基于网络的搜索工具和实验方法，并将描述如何优化这些工具以用于模型生物的基因敲除 (KO) 和基因敲入 (KI)。我们还讨论了精准基因组编辑及其应用的未来方向，以及目标选择方面的挑战，特别是在预测脱靶效应方面。
基因组编辑的当前状态及其含义
基因组编辑涉及使用定位的核酸酶（例如锌指核酸酶，Talens或CRISPR/CAS9）切割DNA双螺旋，并在基因组DNA中的靶向，特定序列引入双链断裂（DSB）。实际上是一对成熟的分子剪刀。然后，使用两种机制之一，通过细胞中的机械修复DSB。一种方法是非同源末端连接（NHEJ），其中两个破裂的末端彼此并排并粘合在一起。此方法容易出错，并且由于维修过程中不可避免的错误，在目标裂解位点会导致目标切割部位的插入和缺失（Indels）。这些误差会改变核酸酶目标位点，并防止进一步的切割事件，并通常禁用或敲除基因功能。另一种修复机制是使用同源核酸修复模板的同源指导修复（HDR）。修复模板可以设计与DSB两侧匹配的同源性区域之间进行所需的修改。这可用于引入一系列基因组编辑，从点突变到全基因插入。
工程自动核解哺乳动物悬架宿主细胞系，以降低无血清慢病毒过程流中的DNA杂质水平
摘要：我们用转基因编码四环素诱导的金黄色葡萄球菌核酸酶，并结合了易位信号。我们调整了未修饰和核酸酶工程的细胞系在无血清培养基中的悬浮液中生长，分别产生HEK293TS和NUPRO-2S细胞系。瞬时转染产生的1.19×10 6慢病毒转染来自Nupro-2S细胞的每毫升（TU/mL），HEK293TS细胞的1.45×10 6 Tu/ml。DNA梯子消失揭示了以四环素诱导的方式由NUPRO-2S细胞引起的中等居民核酸酶活性。DNA杂质水平在NUPRO-2S和HEK293TS细胞引起的慢病毒材料中无法通过SYBR安全琼脂糖凝胶染色检测到。通过PICOGREEN试剂进行直接测量表明，在HEK293TS细胞的慢病毒材料中，DNA以636 ng/ml的形式存在，在Nupro-2S细胞的慢病毒材料中，杂质水平降低了89％至70 ng/ml。通过使用50个单位/mL苯并酶处理HEK293TS衍生的慢病毒材料，这种还原与23 ng/ml相当。关键词：慢病毒，哺乳动物细胞，生物普应，基因治疗，核酸酶
细胞外G-四链体和Z-DNA保护生物膜免受DNase I的侵害，并形成具有过氧化物酶活性的DNAZyme
z-DNA和G-四链体DNA在生物膜基质中很丰富，并且使用与鼠植入物相关的骨髓炎模型在体外和体内生长的生物膜中通常存在于网络类似结构中。在体外，在生物膜生长期间没有NaCl或机械摇动的情况下，或在EDNA或外多糖产生的细菌菌株中没有形成结构。因此，我们推断出EDNA和多糖相互作用，当通过盐稳定时，在机械应力下导致非典型的DNA结构，我们证实了来自感染植入物的生物膜中的G-四链体DNA和Z-DNA也存在。哺乳动物DNase I缺乏针对Z-DNA和G-四链体DNA的活性，而微球菌核酸酶可能会降解G-四链体DNA，而S1 Aspergillus核酸酶可能会降解Z-DNA。因此，源自金黄色葡萄球菌的微球菌核酸酶可能是分散生物膜在葡萄球菌中的关键。除了其结构作用外，我们首次表明，生物膜中的埃德纳在Hemin存在下形成具有过氧化物酶样活性的DNAZyme。虽然过氧化物酶是针对病原体防御的一部分，但我们现在表明生物膜可以在细胞外基质中具有内在的过氧化物酶活性。
控制CRISPR激活质粒：SC-437275
定期间隔间隔的短质体重复序列（CRISPR）和与CRISPR相关的蛋白质（CAS9）系统是ARCHEA和细菌使用的一种适应性免疫反应防御机制，用于降解前遗传材料。该机制可以用于其他功能，包括用于哺乳动物系统的基因组工程，例如基因敲除（KO）（KO）（1,2）和基因激活（3-6）。CRISPR Activation Plasmid products enable the identification and upregulation of specific genes by utilizing a D10A and N863A deactivated Cas9 (dCas9) nuclease fused to a VP64 acti- vation domain, in conjunction with sgRNA (MS2), a target-specific sgRNA engineered to bind the MS2-P65-HSF1 fusion protein (6).这种协同激活介质（SAM）转录激活系统提供了一个强大的系统，以最大程度地激活内源基因表达（6）。
基因组编辑生物文件草案
bp：碱基对 CRISPR：成簇的规律间隔的短回文重复序列 Cas：CRISPR 相关系统 DNA：脱氧核糖核酸 DSB：双链断裂 GE：基因工程 GEd：基因编辑 EPA：环境保护法 HDR：同源定向修复 HR：同源重组 Indel：插入/删除 kbp：千碱基对 MN：巨核酸酶 NHEJ：非同源末端连接 nt：核苷酸 ODM：寡核苷酸定向诱变 PN：可编程核酸酶 rDNA：重组 DNA RGENs：RNA 引导的工程核酸酶 SSB：单链断裂 SDN：定点核酸酶 TALEN：转录激活因子样效应核酸酶 ZFN：锌指核酸酶 ZFP ：锌指蛋白
CRISPR-TAPE：以蛋白质为中心的 CRISPR 引导设计，用于靶向蛋白质组工程
CRISPR 原核防御系统 (Barrangou et al , 2007; Jinek et al , 2012) 的发现及其转化为有效且高效的基因组工程机制 (Cong et al , 2013; Mali et al , 2013; Ran et al , 2013) 的发现彻底改变了功能基因组学。CRISPR 技术依赖于将 RNA 引导的核酸内切酶靶向基因组内的特定序列位置。该系统已用于各种基因组修饰策略，包括基因敲除（通过错误修复断裂）和定点诱变（通过提高同源性定向修复的效率，在靠近断裂的基因组区域整合 DNA 模板）。在大多数应用中，将核酸酶准确靶向基因组位点比酶活性的特定核苷酸位置优先。虽然核酸酶工程化推动了该系统可支持的技术多样化（Pickar-Oliver & Gersbach，2019），但控制核酸酶靶向的分子规则保持不变；基因组地址编码在向导 RNA 序列 (gRNA) 中，该序列定义为位于原间隔区相邻基序 (PAM) 之前的 20 个核苷酸的基因组 DNA 片段。有大量的生物信息学工具可用
小分子调控的 sgRNA 能够通过 Cas9 控制大肠杆菌中的基因组编辑
CRISPR-Cas9 已为广泛应用的基因编辑带来了巨大进步。为了进一步发挥 Cas9 的效用，人们一直在努力实现对其核酸酶活性的时间控制。虽然不同的方法都侧重于调节哺乳动物细胞中的 CRISPR 干扰或编辑，但所有报道的方法都无法控制细菌中的核酸酶活性。在这里，我们开发了 RNA 接头，将茶碱和 3-甲基黄嘌呤 (3MX) 结合适体与 sgRNA 结合起来，从而实现大肠杆菌中的小分子依赖性编辑。这些可激活的向导 RNA 能够实现对体内基因编辑的时间和转录后控制。此外，它们还减少了因基因组切割而导致的宿主细胞死亡，这是 CRISPR 介导的细菌重组的主要限制。
CRISPR/Cas9 基因编辑如何彻底改变 T 细胞研究
简介成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR)/Cas9 彻底改变了科学家在生物学和医学所有领域的研究方式。通过轻松、快速和精确地操纵遗传密码，科学家可以以前所未有的速度和精度探究新基因的作用。 Jennifer Doudna 和 Emmanuelle Charpentier 因发现 CRISPR/Cas9 而获得 2020 年诺贝尔奖，这标志着一场生物学革命的开始。 CRISPR 是在细菌中发现的一种防御机制，它通过引导 DNA 切割核酸酶到外来基因组 DNA 来破坏入侵的细菌病毒（即噬菌体）的外来 DNA（Makarova 等人，2006 年；Barrangou 等人，2007 年；Garneau 等人，2010 年）。此后，人们发现了多种可以切割外来 DNA 的 CRISPR 核酸酶，其中研究最多的是单亚基 II 型 CRISPR 核酸酶 Cas9。CRISPR/Cas9 不是第一个或唯一的基因编辑工具，但它可以高精度、轻松地编辑基因组的大多数部分。在 T 细胞免疫学中，CRISPR/Cas9 的应用使科学家能够研究哪些基因是癌症免疫逃避所必需的（Kearney 等人，2018 年；Pan 等人，2018 年；Lawson 等人，2020 年），免疫介导的癌症消除