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连接辅助同源重组通过部署 MMEJ 和 HDR 实现精确的基因组编辑
CRISPR / Cas12a 是一种单效应核酸酶，与 CRISPR / Cas9 一样，由于其能够产生靶向 DNA 双链断裂 (DSB) 而被用于基因组编辑。与 Cas9 产生的平端 DSB 不同，Cas12a 产生的粘性末端 DSB 可能有助于精确的基因组编辑，但这一独特功能迄今为止尚未得到充分利用。在当前的研究中，我们发现，短双链 DNA (dsDNA) 修复模板包含一个与 Cas12a 产生的 DSB 末端之一匹配的粘性末端和一个与 DSB 另一端相邻的基因组区域具有同源性的同源臂，能够精确修复 DSB 并引入所需的核苷酸替换。我们将这种策略称为“连接辅助同源重组”(LAHR)。与单链寡脱氧核糖核苷酸 (ssODN) 介导的同源定向修复 (HDR) 相比，LAHR 的编辑效率相对较高，这在报告基因和内源基因中均有体现。我们发现 HDR 和微同源介导的末端连接 (MMEJ) 机制都参与了 LAHR 过程。我们的 LAHR 基因组编辑策略扩展了基因组编辑技术的范围，并更广泛地了解了基因组编辑中涉及的 DNA 修复机制的类型和作用。
cRISPR靶向H3K4ME3激活基因表达并解锁拟南芥中的丝粒跨界重组
。cc-by-nc-nd 4.0国际许可证。根据作者/资助者提供了预印本（未经同行评审的认证）提供的，他已授予Biorxiv的许可证，以在2025年2月8日发布的此版本中在版权所有者中显示预印本。 https://doi.org/10.1101/2025.02.07.636860 doi：Biorxiv Preprint
多路复用细菌素合成以杀死和预防抗菌抗性
。cc-by-nc-nd 4.0国际许可证（未经同行评审证明）获得的是作者/资助者，他授予Biorxiv授予Biorxiv的许可，以永久显示预印本。这是该预印本版本的版权持有人，该版本发布于2024年9月3日。 https://doi.org/10.1101/2024.09.09.03.609457 doi：Biorxiv Preprint
sarco/内质网Ca2+-ATPase（SERCA）活性是V（d）J重组
全基因组CRISPR/CAS9屏幕鉴定出ATP2A2，该基因编码sarco/ca 2+ -ATPase（SERCA）2蛋白，对V（d）J重组很重要。SERCAS是ER跨膜蛋白，可将Ca 2+从胞质液泵入ER管腔中，以维持ER Ca 2+储层并调节胞质Ca 2+依赖性过程。在PERB细胞中，SERCA2的丢失导致V（D）J重组动力学减少，这是由于抹布介导的DNA裂解减少。B细胞中的SERCA2缺乏会导致SERCA3的表达增加，SERCA2和SERCA3的综合损失导致ER Ca 2+水平降低，胞质Ca 2+水平升高，RAG1和RAG2基因表达的降低以及V（D）J重组的深刻障碍。由杂合ATP2A2突变引起的SERCA2和人类缺乏B细胞的小鼠，成熟的B细胞数量减少。我们得出的结论是，SERCA蛋白调节细胞内Ca 2+水平以调节RAG1和RAG2基因表达以及V（D）J的重组以及SERCA功能的缺陷会导致淋巴细胞减少。
Plasmid2MC：高效无细胞重组质粒成高纯度微环 DNA 用于基因组编辑应用
DNA 质粒通常用于在基因组编辑中传递蛋白质和 RNA。然而，与缺乏此类细菌序列的微环 DNA (mcDNA) 相比，它们的细菌成分可能导致失活、细胞毒性和效率降低。现有的将质粒重组到专有细菌菌株内的 mcDNA 中的商业试剂盒劳动密集型，产生的结果不一致，并且通常产生低质量的 mcDNA。为了解决这个问题，我们开发了 Plasmid2MC，这是一种使用 Φ C31 重组的无细胞方法，可有效从常规制备的质粒中切除细菌骨架，而 mcDNA 纯化步骤可消化所有 DNA 杂质并降低内毒素水平。我们展示了 mcDNA 表达 CRISPR-dCas9 在 HEK293T 细胞和小鼠胚胎干细胞中的碱基编辑以及同源性独立的靶向插入 (HITI) 基因组编辑中的应用。该方法易于制备、效率高且 mcDNA 纯度高，使其成为需要细菌无骨架环状 DNA 的应用的宝贵替代方案。
（缺少）DNA双链断休息途径在V（d）J重组期间选择
DNA双链断裂（DSB）是可以通过多种DNA修复途径修复的剧毒病变。多个因素可能会影响修复对给定途径的选择和限制，以保证维持基因组完整性。在V（D）J重组期间，RAG诱导的DSB（几乎）是通过非同理端连接（NHEJ）途径仅修复的，以实现抗原受体基因多样性的益处。在这里，我们回顾了将RAG生成的DSB修复到NHEJ的各种参数，包括RAG核酸酶产生的DNA DSB末端的特殊性，裂解后突触复合物的建立和维护，以及DNA末端的DNA末端的末端抗切除和（Microtro）的人体学修复。在这种生理背景下，我们强调某些DSB的DNA修复途径选择有限。
senataxin和rNase H2起作用，以抑制类开关重组期间的基因组不稳定性
抽象类开关重组产生的不同的抗体同种型对鲁棒的适应性免疫系统至关重要，并且缺陷与自身免疫性疾病和淋巴瘤相关。在类开关重组期间需要转录才能募集胞苷脱氨酶AID（这是形成DNA双链断裂的重要步骤），并强烈诱导了免疫球蛋白重链链基因座内的R环形成。但是，R回路对上课开关重组期间双链断裂形成和修复的影响尚不清楚。在这里，我们报告说，缺乏参与R环去除的酶的细胞 - 纳经素和RNase H2 - 证明在免疫球蛋白重链重链链路上增加了R环的形成和基因组不稳定性，而不会影响其转录活性，辅助招募或类转换的重组效率。senataxin和RNase H2缺陷型细胞在开关连接处也表现出增加的插入突变，这是替代末端连接的标志。重要的是，在缺乏鼻蛋白酶或RNase H2b的细胞中未观察到这些表型。我们提出，Senataxin用RNase H2冗余起作用，以介导及时的R环去除，从而促进有效的修复，同时抑制辅助依赖性基因组不稳定性和插入诱变。
高分辨率单型pangenome发现燕麦皇冠锈病中的体细胞杂交，重组和洲际迁移
。cc-by-nc-nd 4.0国际许可证未通过同行评审获得证明）是作者/资助者，他已授予Biorxiv授予Biorxiv的许可，以永久显示预印本。它是此预印本的版权持有人（该版本发布于2024年4月1日。; https：//doi.org/10.1101/2024.03.27.583983 doi：biorxiv Preprint
通过 CRISPR/Cas 介导的同源重组在模型硅藻 Thalassiosira pseudonana 中进行有效的基因替换
CRISPR/Cas 能够对包括模型硅藻 Thalassiosira pseudonana 在内的许多不同植物和藻类进行靶向基因组编辑。然而，迄今为止，仅报道了通过同源重组 (HR) 实现的有效基因靶向适用于单倍体生命周期阶段的光合生物。在这里，使用 Golden Gate 克隆组装的 CRISPR/Cas 构建体能够在二倍体光合生物中实现高效的 HR。使用序列特异性 CRISPR/Cas 并与 dsDNA 供体基质配对，在 T. pseudonana 中诱导同源重组，从而用抗性盒 (FCP: NAT) 替换 silacidin、硝酸还原酶和脲酶基因。通过嵌套 PCR 筛选出高达约 85% 的 NAT 抗性 T. pseudonana 菌落对 HR 呈阳性。使用反向 PCR 方法确认了 FCP: NAT 在每个位点的精确整合。硝酸还原酶和尿素酶基因的敲除分别影响了硝酸盐和尿素的生长，而 T. pseudonana 中 silacidin 基因的敲除导致细胞尺寸显著增加，证实了该基因在中心硅藻中调节细胞尺寸的作用。HR 的高效基因靶向使 T. pseudonana 像 Nannochloropsis 和 Physcomitrella 一样易于遗传处理，从而迅速推进了功能性硅藻生物学、生物纳米技术和生物技术应用，这些应用旨在利用硅藻的代谢潜力。
通过无标记富集和重组基因工程位点 (MERGE) 实现快速、可扩展的组合基因组工程
‡ 通信地址：aashiq.kachroo@concordia.ca 关键词：基因组工程、CRISPR-Cas9、人源化酵母、蛋白酶体 缩写：CFU、菌落形成单位；DSB、双链断裂；HDR、同源定向 DNA 修复；HR、同源重组；CELECT、基于 CRISPR-Cas9 的选择以丰富基因型；MERGE、无标记富集和重组基因工程位点；SGA、合成遗传阵列