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World File Search System核蛋白
使用预组装的 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白复合物在禾谷镰刀菌中进行基因组编辑
使用成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)-CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9) 系统进行基因组编辑极大地促进了真菌病原体的遗传分析。穗枯萎病真菌禾谷镰刀菌会给具有重要经济价值的谷类作物造成毁灭性损失。最近开发用于禾谷镰刀菌的 CRISPR-Cas9 系统使得基因组编辑更加高效。在本研究中，我们描述了一种基于 CRISPR-Cas9 的基因组编辑工具，用于将预组装的 Cas9 核糖核蛋白 (RNP) 直接递送到禾谷镰刀菌的原生质体中。使用 RNP 显著增加了转化子的数量和成功用选择标记替换目标基因的转化子的百分比。我们表明，由 Cas9 核糖核蛋白介导的单个双链 DNA 断裂足以实现基因删除。此外，短同源重组仅需要靶基因两侧 50 个碱基对区域。Cas9 RNPs 的高效率使得大规模功能分析、必需基因的鉴定和基因删除成为可能，而这些是传统方法难以实现的。我们期望我们的方法将加速禾谷镰刀菌的遗传学研究。
利用冲击波介导的核糖核蛋白递送对烟草 ADF 基因进行定向诱变，提高渗透胁迫耐受性
建立了工作流程后，我们随后使用脉冲激光诱导冲击波法将 RNP 直接递送到完整的烟草叶片细胞中，这比原生质体或受精卵更容易制备和处理。我们引入了一个预组装的 RNP，它包含 HiFi Cas9 蛋白、crispr RNA (crRNA) 和 ATTO-550 标记的反式激活 crispr RNA (tracrRNA)，靶向烟草 PDS 或 ADF 基因。荧光 tracrRNA 允许直接筛选转染细胞，因此不需要选择标记基因（图 2A'）。样本大小和实验设置与上面描述的 DsRed 转染相同（图 1A、B）。根据我们的观察，ATTO-550 荧光在激光处理后 24 小时开始变得可见，在转染后 48 小时达到最大值。根据制造商的说法，RNP 复合物的活性最长为 72 小时。
通过预复合的 CRISPR-Cas9/sgRNA 核糖核蛋白避开细胞抑制 RNA，实现高效的 ssODN 介导靶向
结合 CRISPR-Cas9 技术和单链寡脱氧核苷酸 (ssODN)，可以在诱导性多能干细胞 (iPSC) 中的目标基因组位点引入特定的单核苷酸改变；然而，与缺失诱导相比，ssODN 敲入频率较低。尽管已报道了几种 Cas9 转导方法，但是 CRISPR-Cas9 核酸酶在哺乳动物细胞中的生化行为仍有待探索。在这里，我们研究了影响 Cas9 体外裂解活性的内在细胞因素。我们发现细胞内 RNA（而不是 DNA 或蛋白质部分）会抑制 Cas9 与单向导 RNA (sgRNA) 结合并降低酶活性。为了防止这种情况，与 Cas9 过表达方法相比，在递送到细胞之前预复合 Cas9 和 sgRNA 可产生更高的基因组编辑活性。通过优化预复合核糖核蛋白和ssODN的电穿孔参数，我们实现了高达70%的单核苷酸校正效率和高达40%的loxP插入效率。最后，我们可以用C2等位基因替换HLA-C1等位基因，以生成组织相容性白细胞抗原定制编辑的iPSC。
ReMOT 控制递送 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白复合物以诱导疾病媒介蚊子淡色库蚊的种系诱变
淡色库蚊复合体分布广泛，导致蚊媒疾病在人类中的传播难以预防。使用 CRISPR/Cas9 基因编辑是一种有效的技术，有可能解决日益严重的蚊媒疾病问题。本研究利用 ReMOT 控制技术在淡色库蚊中生产转基因蚊子。通过注射 60 只成年雌蚊建立了显微注射系统——需 14 µ l 注射混合物，使用≤1 µ l 的内体释放试剂（氯喹或皂苷）不会发生沉淀。在采血后 24 小时（卵黄发生高峰期）注射 P2C 增强型绿色荧光蛋白-Cas9（P2C-EGFP-Cas9）核糖核蛋白复合物进入卵巢的效率为 100%。利用此方法进行KMO敲除，我们发现当通过ReMOT Control将P2C-Cas9 RNP复合物注射到淡色库蚊成年血淋巴中时，卵巢中也能发生基因编辑。在氯喹组，筛选出的2,251只G 0 子代中，9只个体表现出白眼和马赛克眼表型。在皂苷组，筛选出的2,462只G 0 子代中，观察到8只突变个体。测序结果显示13 bp的缺失，进一步证实了发生基因编辑的事实。总之，ReMOT Control在淡色库蚊中的成功应用，不仅为该方法提供了基本参数（注射参数和注射时间），而且有利于蚊虫生物学和防治的研究。
使用 dpy-10 Co-CRISPR 筛选标记和组装的核糖核蛋白复合物对 C. elegans rbm-3.2 基因进行 CRISPR/Cas9 编辑。
使用 dpy-10 Co-CRISPR 筛选标记和组装的核糖核蛋白复合物对 C. elegans rbm-3.2 基因进行 CRISPR/Cas9 编辑。
基于吸附性二氧化硅纳米结构的体内递送增强治疗性核糖核蛋白的基因编辑和碱基编辑
基因组编辑工具广泛安全应用的关键是将核糖核蛋白 (RNP) 的多种成分安全有效地递送到单细胞中，但这仍是其临床应用的生物障碍。为了解决这个问题，设计了一种基于生物相容性海绵状二氧化硅纳米结构 (SN) 的强大 RNP 递送平台，用于储存和直接递送治疗性 RNP，包括 Cas9 核酸酶 RNP (Cas9-RNP) 和碱基编辑器 RNP (BE-RNP)。与基于脂质的方法等商业化材料相比，通过靶向各种细胞和基因，可获得高达 50 倍的基因删除和 10 倍的碱基替换效率，且脱靶效率低。特别是，通过体内实体瘤模型中的静脉注射和小鼠眼中视网膜下注射的基于 SN 的递送成功诱导基因校正。此外，由于其毒性低、生物降解性高，SN 对器官细胞功能的影响微乎其微。由于工程化的 SN 可以克服与治疗性 RNP 应用相关的实际挑战，因此人们强烈期望该平台能够成为模块化 RNP 递送系统，从而促进体内基因删除和编辑。
RBM20 获得功能性心肌病突变重新连接剪接调控并重新分配处理体内的核糖核蛋白颗粒
心脏剪接因子 RBM20 的突变会导致恶性扩张型心肌病 (DCM)。为了了解 RBM20 相关 DCM 的机制，我们设计了具有 DCM 相关 RBM20 错义突变的同源 iPSC 以及 RBM20 敲除 (KO) iPSC。由这些细胞系制成的 iPSC 衍生的工程心脏组织重现了 RBM20 相关 DCM 的收缩功能障碍，并且显示错义突变的功能障碍比 KO 更严重。通过 eCLIP 对 RBM20 RNA 结合的分析表明，突变型 RBM20 对与肌萎缩侧索硬化症 (ALS) 和加工体相关 RNA 结合蛋白 (FUS、DDX6) 共享的 3′UTR 序列具有功能获得偏好。深度 RNA 测序表明，RBM20 R636S 突变体具有独特的基因、剪接、多聚腺苷酸化和环状 RNA 缺陷，与 RBM20 KO 不同。超分辨率显微镜验证了突变体 RBM20 保持非常有限的核定位潜力；相反，突变蛋白在基础条件下与细胞质加工体 (DDX6) 结合，在急性应激后与应激颗粒 (G3BP1) 结合。总之，我们的结果强调了通过剪接依赖和非剪接途径导致心脏疾病的致病机制。
准备的特发性快速眼动睡眠行为患者
1。Arnulf I. REM睡眠行为障碍：运动表现和病理生理学。MOV DISORD。 2012; 27（6）：677-689。 2。 Galbiati A，Verga L，Giora E，Zucconi M，Ferini-Strambi L. REM睡眠行为障碍中神经退行性的风险：纵向研究的系统评价和荟萃分析。 睡眠医学修订。 2019; 43：37-46。 doi：10.1016/j.smrv.2018.09.008 3。 Antelmi E，Pizza F，Donadio V等。 特发性和麻醉性患者的REM睡眠行为障碍的生物标志物。 Ann Clin Transl Neurol。 2019; 6（9）：1872-1876。 doi：10.1002/acn3.50833 4。 多普勒K，Antelmi E，Kuzkina A等。 REM睡眠行为障碍中的皮肤α-突触核蛋白阳性 - 两到四年的随访研究。 帕金森主义关系疾病。 2021; 86：108-113。DOI：10.1016/j.parkreldis.2021.04.007 5。 伊朗A，Fairfoul G，Ayudhaya Acn等。 在CSF中通过RT-QUIC检测孤立的快速移动睡眠行为障碍患者的CSF：一项纵向观察性研究。 柳叶刀神经。 2021; 20（3）：203-212。 doi：10.1016/s1474-4422（20）30449-X 6。 Poggiolini I，Gupta V，Lawton M等。 脑脊液α-突触核蛋白种子定量的诊断值。 大脑。 2022; 145（2）：584-595。 doi：10.1093/brain/awab431MOV DISORD。2012; 27（6）：677-689。 2。 Galbiati A，Verga L，Giora E，Zucconi M，Ferini-Strambi L. REM睡眠行为障碍中神经退行性的风险：纵向研究的系统评价和荟萃分析。 睡眠医学修订。 2019; 43：37-46。 doi：10.1016/j.smrv.2018.09.008 3。 Antelmi E，Pizza F，Donadio V等。 特发性和麻醉性患者的REM睡眠行为障碍的生物标志物。 Ann Clin Transl Neurol。 2019; 6（9）：1872-1876。 doi：10.1002/acn3.50833 4。 多普勒K，Antelmi E，Kuzkina A等。 REM睡眠行为障碍中的皮肤α-突触核蛋白阳性 - 两到四年的随访研究。 帕金森主义关系疾病。 2021; 86：108-113。DOI：10.1016/j.parkreldis.2021.04.007 5。 伊朗A，Fairfoul G，Ayudhaya Acn等。 在CSF中通过RT-QUIC检测孤立的快速移动睡眠行为障碍患者的CSF：一项纵向观察性研究。 柳叶刀神经。 2021; 20（3）：203-212。 doi：10.1016/s1474-4422（20）30449-X 6。 Poggiolini I，Gupta V，Lawton M等。 脑脊液α-突触核蛋白种子定量的诊断值。 大脑。 2022; 145（2）：584-595。 doi：10.1093/brain/awab4312012; 27（6）：677-689。2。Galbiati A，Verga L，Giora E，Zucconi M，Ferini-Strambi L. REM睡眠行为障碍中神经退行性的风险：纵向研究的系统评价和荟萃分析。睡眠医学修订。2019; 43：37-46。 doi：10.1016/j.smrv.2018.09.008 3。 Antelmi E，Pizza F，Donadio V等。 特发性和麻醉性患者的REM睡眠行为障碍的生物标志物。 Ann Clin Transl Neurol。 2019; 6（9）：1872-1876。 doi：10.1002/acn3.50833 4。 多普勒K，Antelmi E，Kuzkina A等。 REM睡眠行为障碍中的皮肤α-突触核蛋白阳性 - 两到四年的随访研究。 帕金森主义关系疾病。 2021; 86：108-113。DOI：10.1016/j.parkreldis.2021.04.007 5。 伊朗A，Fairfoul G，Ayudhaya Acn等。 在CSF中通过RT-QUIC检测孤立的快速移动睡眠行为障碍患者的CSF：一项纵向观察性研究。 柳叶刀神经。 2021; 20（3）：203-212。 doi：10.1016/s1474-4422（20）30449-X 6。 Poggiolini I，Gupta V，Lawton M等。 脑脊液α-突触核蛋白种子定量的诊断值。 大脑。 2022; 145（2）：584-595。 doi：10.1093/brain/awab4312019; 43：37-46。doi：10.1016/j.smrv.2018.09.008 3。Antelmi E，Pizza F，Donadio V等。特发性和麻醉性患者的REM睡眠行为障碍的生物标志物。Ann Clin Transl Neurol。 2019; 6（9）：1872-1876。 doi：10.1002/acn3.50833 4。 多普勒K，Antelmi E，Kuzkina A等。 REM睡眠行为障碍中的皮肤α-突触核蛋白阳性 - 两到四年的随访研究。 帕金森主义关系疾病。 2021; 86：108-113。DOI：10.1016/j.parkreldis.2021.04.007 5。 伊朗A，Fairfoul G，Ayudhaya Acn等。 在CSF中通过RT-QUIC检测孤立的快速移动睡眠行为障碍患者的CSF：一项纵向观察性研究。 柳叶刀神经。 2021; 20（3）：203-212。 doi：10.1016/s1474-4422（20）30449-X 6。 Poggiolini I，Gupta V，Lawton M等。 脑脊液α-突触核蛋白种子定量的诊断值。 大脑。 2022; 145（2）：584-595。 doi：10.1093/brain/awab431Ann Clin Transl Neurol。2019; 6（9）：1872-1876。 doi：10.1002/acn3.50833 4。 多普勒K，Antelmi E，Kuzkina A等。 REM睡眠行为障碍中的皮肤α-突触核蛋白阳性 - 两到四年的随访研究。 帕金森主义关系疾病。 2021; 86：108-113。DOI：10.1016/j.parkreldis.2021.04.007 5。 伊朗A，Fairfoul G，Ayudhaya Acn等。 在CSF中通过RT-QUIC检测孤立的快速移动睡眠行为障碍患者的CSF：一项纵向观察性研究。 柳叶刀神经。 2021; 20（3）：203-212。 doi：10.1016/s1474-4422（20）30449-X 6。 Poggiolini I，Gupta V，Lawton M等。 脑脊液α-突触核蛋白种子定量的诊断值。 大脑。 2022; 145（2）：584-595。 doi：10.1093/brain/awab4312019; 6（9）：1872-1876。doi：10.1002/acn3.50833 4。多普勒K，Antelmi E，Kuzkina A等。REM睡眠行为障碍中的皮肤α-突触核蛋白阳性 - 两到四年的随访研究。帕金森主义关系疾病。2021; 86：108-113。DOI：10.1016/j.parkreldis.2021.04.007 5。伊朗A，Fairfoul G，Ayudhaya Acn等。在CSF中通过RT-QUIC检测孤立的快速移动睡眠行为障碍患者的CSF：一项纵向观察性研究。柳叶刀神经。2021; 20（3）：203-212。doi：10.1016/s1474-4422（20）30449-X 6。Poggiolini I，Gupta V，Lawton M等。脑脊液α-突触核蛋白种子定量的诊断值。大脑。 2022; 145（2）：584-595。 doi：10.1093/brain/awab431大脑。2022; 145（2）：584-595。doi：10.1093/brain/awab431
利用 CRISPR-Cas9 和体外组装的核糖核蛋白操纵全局调节器 mcrA 上调温曲霉中的次级代谢产物
摘要：丝状真菌基因组测序表明，大多数次级代谢物生物合成基因簇 (BGC) 在标准实验室条件下处于沉默状态。在这项研究中，我们在温氏曲霉中建立了一个体外 CRISPR-Cas9 系统。为了激活原本沉默的 BGC，我们删除了负转录调节因子 mcrA 。当菌株在马铃薯葡萄糖培养基 (PDA) 上培养时，mcrA (mcrA Δ) 的缺失导致总共产生 17 种 SM。在 15 种 SM 中，有 9 种已得到充分表征，包括大黄素 ( 1 )、大黄酸乙酯 ( 2 )、sulochrin ( 3 )、大黄酸乙酯二蒽酮 ( 4 )、14- O-脱甲基sulochrin ( 5 )、( 反式 / 顺式 )-大黄素二蒽酮 ( 6 和 7 ) 和 ( 反式 / 顺式 )-大黄素大黄酸乙酯二蒽酮 ( 8 和 9 )。经发现，这些化合物均由相同的聚酮合酶 (PKS) BGC 产生。随后，我们在 mcrA Δ 背景下针对该 PKS 簇进行了二次敲除。双敲除菌株的代谢物谱揭示了先前未在 mcrA Δ 亲本菌株中检测到的新代谢物。从双敲除菌株中纯化出另外两种 SM，并被鉴定为曲霉酸 B ( 16 ) 和一种结构相关但之前未鉴定的化合物 ( 17 )。这项工作首次提出了一种能够在 A.wentii 中进行靶向基因编辑的简便遗传系统。这项工作还说明了进行双敲除以消除主要代谢产物的实用性，从而能够发现更多的 SM。■ 简介