评估了三种流动相改性剂,以确定其对寡核苷酸 LC/MS 分离和灵敏度的影响(图 1)。本研究评估的流动相缓冲液包括碳酸氢铵、醋酸铵和甲酸铵,流动相 A 中的浓度均为 20 mM。醋酸铵和甲酸铵缓冲液用氢氧化铵调节至 pH 8.5,而碳酸氢铵缓冲液未调节 pH。LC/UV 结果表明,14、17、20 和 21 碱基 RNA 样品在 RP 柱上的分离效果相似,20 碱基和 21 碱基 RNA 之间的平均分离度为 R = 1.47。这表明进一步的梯度优化可以实现 n-1 杂质的基线分离(R = 1.5),而生物制药中经常监测这些杂质。
NORGEN的纯化技术纯化基于自旋色谱柱色谱法。优先从其他细胞成分(例如基因组DNA和RNA)中纯化质粒DNA。该过程涉及首先颗粒的隔夜细菌培养物具有质粒DNA(请参阅第3页的流程图)。然后,使用提供的重悬溶液AZ重悬细菌颗粒,并使用裂解缓冲液N进行细菌。然后添加缓冲液。然后添加缓冲液TN,从而导致溶液中存在的基因组DNA和蛋白质。然后通过离心阐明裂解物,以去除含有质粒DNA的裂解物中的沉淀蛋白和基因组DNA。然后将澄清的裂解物加载到自旋柱上。Norgen的柱以取决于离子浓度的方式结合DNA,因此,只有质粒DNA才能与柱结合,而大多数消化的RNA和蛋白质将在流动中除去或保留在柱床的顶部。然后用提供的洗涤溶液J洗涤结合的DNA,以去除剩余的杂质。最后,无内毒素纯化的质粒DNA用洗脱缓冲液洗脱。纯化的DNA是最高质量的,可用于许多下游应用,包括测序,克隆和转染。
产品描述快速-DNA/RNA™水试剂盒可提供无抑制剂的核酸分离,从至50 mL的原始废水或更高的低生物质水样品中。该套件包括废水稳定缓冲液,用于废水样品制备的专门解决方案以及一种新型的抑制剂去除技术,以确保洗脱的DNA/RNA已准备好用于任何下游应用。废水稳定缓冲液促进了病毒,微生物和游离核酸的浓度,消除了对真空过滤的需求。此缓冲液还可以将病原体灭活添加到水样中并稳定DNA/RNA在环境温度下最多1周,从而可以安全,无链条的储存和运输。DNA/RNA纯化工作流程包括新型的Zymo-Spin™IV- IR HRC抑制剂去除技术,用于稳健的核酸分离。
如果将抑制剂化合物溶于水中,则使化合物的溶液比1倍测定缓冲液中的最终浓度高5倍(因为您将在25 µL反应中添加5 µL)。然后,从该溶液到您首选的浓度中的1倍测定缓冲液中进行一系列稀释液。如果将抑制剂化合物溶解在DMSO中,则比您要在DMSO中测试的最高浓度高100倍。然后在1倍测定缓冲液中进行20倍稀释(在此步骤中,化合物浓度比最终浓度高5倍,而DMSO浓度为5%)。然后,从该溶液到您首选的浓度中的5%DMSO中的5%的DMSO稀释。由于将5 µL的化合物溶液添加到25 µL反应中,因此所有反应中DMSO的最终浓度均为1%。3。准备DNA pol theta溶液。
在开始以下步骤之前,请阅读重要的笔记。1。将多达200 µL样品(全血,血清,血浆,体液,Buffy Coat)转移到微分离管(未提供)。- 如果样品体积小于200 µL,请添加适当的PBS体积。2。(可选):如果需要无RNA的基因组DNA,则将4 µL的100 mg/ml RNase A加入样品中,并在室温下孵育2分钟。3。将20 µL蛋白酶K和200 µL Fabg缓冲液加到样品中。通过脉冲涡流彻底混合。- 请勿将蛋白酶K直接添加到Fabg缓冲液中。4。在60ºC下孵育15分钟以裂解样品。在孵育过程中,每3〜5分钟间隔涡流一次。5。简要旋转管以去除IID内部的滴剂。6。将200 µL乙醇(96〜100%)加到样品中。通过脉冲涡流彻底混合10秒。7。简要旋转管以去除IID内部的滴剂。8。将Fabg Mini柱放在收集管上。小心地将混合物(包括任何沉淀物)转移到Fabg Mini柱中。在6,000 x g处离心1分钟,然后将fabg mini柱放在新的收集管上。9。将400 µL W1缓冲液添加到Fabg Mini柱中,并以全速离心30秒,然后丢弃流通液。- 确保在第一次打开时已将乙醇添加到W1缓冲液中。10。- 确保在第一次打开时已将乙醇添加到洗涤缓冲液中。11。12。将750 µL洗涤缓冲液添加到Fabg Mini柱中,并全速离心30秒,然后丢弃流通液。全速离心3分钟以干燥色谱柱。重要步骤!此步骤将避免残留液体抑制随后的酶促反应。将Fabg Mini柱放在洗脱管上。13。将加热洗脱缓冲液或DDH 2 O(pH 7.5-9.0)加入Fabg Mini柱的膜中心。站立fabg mini柱持续3分钟。- 重要步骤!为了有效洗脱,请确保将洗脱溶液分配到膜中心并完全吸收。14。全速离心1分钟以洗脱总DNA。15。将总DNA存储在4°C或-20°C。
抑制蛋白:将20 mg溶解在10毫升的水或PBS中以获得2mg/ml的库存(1000x)。工作浓度为2µg/ml,因此在1 ml裂解缓冲液中加入1µL汤。亮肽素:将50毫克溶解在10.5毫升的水中,获得10毫米汤(1000x)。工作浓度为10 µm,因此在1 mL裂解缓冲液中加入1μL汤料。
1使用梯子作为TE缓冲液样品确定与DNA片段有关的所有规格。使用Covaris剪切对照基因组DNA(人类雄性)在TE缓冲液中确定与DNA涂片有关的所有规格。剪切时间为30或240。2分辨率定义为两个峰的一半高度或更好的分离。实际分离性能取决于样本和应用。峰值小于一半高度的峰仍然可以通过系统软件准确地识别。