收获细胞、清洗细胞并将其与活化的 ConA 珠子结合。高质量的样品制备对于 CUT&RUN 工作流程至关重要。请注意,建议对某些样品类型(冷冻细胞、细胞核、粘附细胞、组织)进行修改,可在 support.epicypher.com 上找到。该方案包括在初始细胞收获、清洗步骤后以及 ConA 珠子结合后确认样品质量的详细步骤。避免珠子在检测过程中变干和结块,这会导致样品损失并降低 CUT&RUN 产量。
采集了 30 位捐献者的唾液样本,其中 90% 的分析前 DNA 质量 >2 µg。从 27 个样本中提取了 HMW DNA,其中 93% 的产量 >500 ng。提取后,使用 Qubit dsDNA BR 检测试剂盒对 DNA 进行定量,并使用 Femto Pulse 系统(安捷伦科技公司)进行表征。使用 SMRTbell ® 制备试剂盒 3.0 为部分样本制备 HiFi 文库,并使用 SPRQ™ 化学方法在 Revio 系统上进行测序。每个样本都在一个 Revio SMRT 测序池上进行测序。表 1 总结了五个代表性样本的测序数据。这些样本产生了 4.7 到 15.9 µg 的 HMW DNA。HiFi 测序产量为 119 到 133 Gb 的 HiFi 数据,每个基因组的覆盖率为 27 到 40 倍,足以进行全面的 WGS 变异检测。 75% 到 95% 的读数映射到人类参考基因组 (GRCh38)。
HiFi 制备试剂盒 96 和工作流程专为 NGS 液体处理自动化而设计。因此,该协议旨在描述 SRE、剪切、文库制备酶促反应和珠子清理,以指导自动化方法开发,或在某些情况下进行手动制备。由于自动化仪器之间存在差异,可能需要进行本文未描述的修改,以使协议适应您的特定仪器。请访问 WGS 页面或联系您当地的支持团队,获取具有 PacBio 合格方法的仪器列表。该协议是使用 Hamilton NGS STAR MOA 系统开发的。
该试剂盒非常适合定量 RNA,用于下一代测序 (NGS) 或逆转录 PCR (RT-PCR) 等敏感应用。与基于吸光度的测量不同,RNA Broad Range Dye 对 RNA 的选择性高于双链 DNA (dsDNA),并且可以耐受样品中等摩尔量的 dsDNA,而不会对 RNA 定量产生显著影响(图 4)。仍然建议使用纯化的 RNA 样品。该测定还可用于定量小 RNA,例如 miRNA(图 5)以及单链 DNA (ssDNA),尽管与 RNA 相比,ssDNA 发出的荧光信号较低(图 6)。与总 RNA 相比,该测定对 dsRNA 发出的信号非常低(图 7)。
教师备注 本工作表已标准化,因此您可以根据需要进行修改和使用。有些主题可能对学习者来说比较困难,尤其是那些可能令人不安或引起冒犯的主题。请在使用本工作表时注意这一点,并根据需要进行调整。扩展活动
*1 本产品含有沉淀物。搅拌均匀,添加沉淀物,制备染色溶液。 *2 染色溶液可以在几天到一个星期内重复使用几次。请根据使用频率和染色程度使用。 *3 若染色时间增加,脱色所需时间也会增加。如果脱色过夜,将染色时间延长约 45 至 60 分钟将使您获得更清晰的电泳图像。 *4 如果将其放置于室温水中 2 小时,或放置于冰箱中过夜,您将获得清晰且无背景的图像。
根据Bioneer Corporation的预期用途索赔的预期用途,“ Accupater HIV-1定量RT-PCR试剂盒是一种体外诊断试剂盒,用于量化HIV-1(人类免疫缺陷病毒类型1)RNA在人EDTA-Plasma样品中通过实时时间反应(PCR)使用的常见通用系统。该系统包括用于自动核酸提取的ExiPREP DX仪器和实时PCR的外赛车。Accupater HIV-1定量RT-PCR试剂盒旨在与临床表现和其他实验室制造商结合使用,用于HIV-1受感染患者的临床管理。该测试可通过测量基线HIV-1水平来评估患者预后,或者通过测量抗逆转录病毒治疗过程中HIV-1 RNA水平的变化来监测抗逆转录病毒疗法的影响。HIV-1基因型对8.0 log 10 IU/ml(7.74 log 10 cp/ml)的范围内。该试剂盒不打算用作包括血液和血液产品在内的临床样本中HIV-1感染的筛查测试。它不打算对HIV-1感染的初始临床诊断,例如HIV-1筛查。预期的用户
如果您的样本产生了强劲的阳性结果,则数据解释不需要内部提取控制,并且可以忽略。如果您的样品产生了负结果,则内部提取控制对于解释结果很有用。内部提取控制中的CQ值会根据样品中的DNA量而有所不同。晚期信号(CQ> 28)表明您的样品中只有少量的宿主衍生DNA。您可能希望重复样本收集,然后重复测试以确认负面结果。
其他培养基类型 对于特定解决方案,可能需要使用替代培养基类型来隔离可能损害系统的利基细菌。以下是针对此类细菌经常要求使用的一些其他培养基类型: • SRB - 改良 Postgate B (MPB) • SRB - 美国石油协会 (API) • 硫代硫酸盐还原菌 (TRB) • 普通厌氧菌 (GAN) • 兼性和专性厌氧菌硫代乙醇酸盐 (TGC) • 硝酸盐还原菌* (NRB) • 硝酸盐还原硫化物氧化菌 (NRSOB) • 亚硝酸盐还原菌* (NiRB) • 亚硝酸盐氧化菌 (NOB) • 铁氧化菌 (IOB) • 石油降解菌 (ODB)