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全面分析并准确量化 CRISPR-Cas9 基因编辑引起的意外大型基因修饰
迄今为止，大多数基因组编辑分析都是基于量化小插入和缺失。在这里，我们表明 CRISPR-Cas9 基因组编辑可以在不同的原代细胞和细胞系中诱导较大的基因修饰，例如缺失、插入和复杂的局部重排。我们使用不同的方法分析了造血干细胞和祖细胞 (HSPC) 中的大型缺失事件，包括克隆基因分型、液滴数字聚合酶链反应、具有唯一分子标识符的单分子实时测序和长扩增子测序分析。我们的结果表明，在 HSPC 中的 HBB（11.7 至 35.4%）、HBG（14.3%）和 BCL11A（13.2%）基因以及 T 细胞中的 PD-1（15.2%）基因的 Cas9 靶向切割位点处，高达数千个碱基的大量缺失以高频率发生。我们的发现对于推进基因组编辑技术治疗人类疾病具有重要意义，因为非预期的大规模基因修饰可能会持续存在，从而改变生物学功能并减少可用的治疗等位基因。
Prabhakara（Prabha）Nagareddy，M.Pharm，M.Sc.，Phd，Faha
我实验室中的研究广泛地集中在理解心脏代谢疾病中动脉粥样硬化风险的病理基础上。在这方面，我们一直在研究NLRP3炎性体信号在髓样细胞中的作用，特别是中性粒细胞和巨噬细胞。我们已经确定了某些激活NLRP3炎性体的嗜中性粒细胞衍生的警报分子（即S100A8/A9），并促进促炎细胞因子的释放。这些细胞因子传播到骨髓，与骨髓（BM）中的不同造血茎和祖细胞（HSPC）相互作用，以刺激异常的脊髓脉和血栓形成，从而增加了动脉粥样硬化的风险。因此，我们的重点主要是确定与BM中与HSPC相互作用的炎症提示/信号传导介质以促进全身炎症。我们的短期目标是验证和重新利用某些FDA批准的药物以靶向急性和慢性炎症，以改善心脏代谢结果。长期目标是利用我们的研究和其他人的知识来制定新颖的治疗策略，以减轻心血管和心脏代谢性疾病的整体负担。奖项/荣誉： div>
整体和局部操纵 DNA 修复机制以改变造血干细胞中位点特异性基因编辑结果
血液系统的单基因疾病有可能通过体外自体干细胞移植来治疗，移植的是经过基因改造的造血干细胞和祖细胞 (HSPC)。sgRNA/Cas9 系统允许以单核苷酸分辨率精确修改基因组。然而，该系统依赖于内源性细胞 DNA 修复机制来修复 Cas9 诱导的双链断裂 (DSB)，无论是通过非同源末端连接 (NHEJ) 途径还是通过细胞周期调节的同源定向修复 (HDR) 途径。在这里，我们描述了一组异位表达的 DNA 修复因子和 Cas9 变体，评估它们在 HBB 基因座上通过 HDR 促进基因校正或通过 NHEJ 抑制基因破坏的能力。尽管 DNA 修复因子的短暂整体过度表达不会提高原代 HSPC 中基因校正的频率，但通过与 Cas9 蛋白融合将因子定位到 DSB 确实改变了修复结果，朝着微同源介导的末端连接 (MMEJ) 修复（HDR 事件）的方向发展。当可预测的基因编辑结果对于治疗成功至关重要时，这种策略可能很有用。
斑马鱼奇迹：揭示单个血液干细胞...
干细胞是成熟器官中细胞的前体。他们参与了胚胎发生的不同阶段，也参与器官发育的更高级阶段。它们分化为更成熟的细胞，高度取决于其微环境中的信号。造血干和祖细胞（HSPC）是所有血细胞类型的基础。由于它们驻留在一个相当明确的利基市场中，该利基市场由间充质基质细胞（MSC）和内皮细胞（EC）组成，因此它构成了研究HSPCS和小裂细胞之间相互作用的出色模型。这些细胞在胚胎发生过程中很少见，并且会产生。然后，他们在利基市场中找到自己的房屋，并每天产生数十亿个血细胞。在小鼠中，通过在麻醉小鼠上进行手术方法来获取颅骨表面的血管（称为Calvarium）的血管来完成对活动物中这些干细胞的观察，可以使用显微镜对其进行成像。但是，这些传统方法在解决方案方面仍然不足以定义内源性HSPC在其利基市场中的超微结构。
一种受自然启发的用于造血干细胞和祖细胞基因沉默的纳米递送平台
核酸疗法在沉默、表达或编辑基因方面具有巨大潜力。在这里，我们介绍了一种基于天然脂蛋白的纳米递送平台，该平台可防止小干扰 RNA (siRNA) 过早降解，确保其靶向和细胞内递送到骨髓中的造血干细胞和祖细胞 (HSPC)。在建立了一种在其核心中稳定地整合 siRNA 的载脂蛋白脂质纳米颗粒 (aNP) 原型后，我们建立了一个综合库，并彻底表征了单个 aNP 的物理化学性质。在对所有配方进行体外筛选后，我们选择了八种代表库多样性的 siRNA-aNP，并使用静脉给药方案确定了它们沉默小鼠免疫细胞亚群中溶酶体相关膜蛋白 1 (LAMP1) 的能力。我们的数据表明，使用不同的 aNP，我们可以在免疫细胞亚群及其骨髓祖细胞中实现功能性基因沉默。除了基因沉默之外，aNP 平台固有的与免疫细胞结合的能力使其具有向 HSPC 提供其他类型核酸疗法的巨大潜力。
骨髓造血中细胞间信号传导的细胞和分子网络
造血干细胞和祖细胞（HSPC）依靠细胞间信号传导来维持和调整其血液和免疫细胞的产生。此过程发生在半流利的骨髓中，载有数十种不断迁移和相互作用的细胞类型。为了阐明造血造血的基础细胞相互作用和信号转导的动态网络，我们通过整合有关配体和受体表达，细胞类型丰度和细胞空间定位的数据来测量细胞细胞空间相互作用概率（Cellip）的算法。使用新的和已发表的鼠标数据集，我们验证了细胞IP，并发现了指示造血的反馈机制的信号转导。此外，我们在同一造血阶段确定了跨个别HSPC的信号通路之间的显着相关性。这些途径相关性阐明了造血作用的细胞和信号网络的组织，从而通过与已建立的途径揭示了新调节剂。信号定量和相关数据可通过造血界面信号探索器（HISE）获得。关键字：造血，造血茎和祖细胞，骨髓，细胞间信号传导，信号网络，细胞 - 细胞通信，单细胞RNA测序，细胞 - 细胞空间相互作用，反馈机制，PARS PATH
通过CRISPR/CAS9
为了研究克隆造血性基因突变的体外基因突变，并揭示了对人类茎和祖细胞（HSPC）室的直接影响，我们针对健康的，年轻的造血祖细胞，该细胞源自脐带血液样本，并用CRASPR/CAS9技术来源。位点特异性突变，随后在短期和长期的体外培养试验中分析，以评估自我更新和差异能力。菌落形成单元（CFU）测定法显示，TET2突变（TET2 MUT）细胞的自我更新增强，而ASXL1 MUT以及DNMT3A MUT细胞的自我更新并未揭示短期培养的显着变化。引人注目的是，在所有突变体的长期培养实验中都可以检测到增强的菌落形成，表明自我更新能力的增加。尽管我们还可以证明所有突变体的不同细胞克隆的优先克隆膨胀，但长期培养后的克隆组成揭示了对HSPC的突变特异性影响。因此，通过使用原发性脐带血细胞，我们能够研究表观遗传驱动器突变，而不会混淆年龄或复杂的突变景观，而我们的发现为克隆血肿相关突变对人类茎和前代细胞的自治和核心组成的直接影响提供了证据。
庞贝病基因治疗进展
摘要：庞贝病是一种遗传性神经肌肉疾病，由溶酶体酶酸性 α-葡萄糖苷酶 (GAA) 缺乏引起。最严重的形式是婴儿期庞贝病，出生后不久即出现心肌病、呼吸衰竭和骨骼肌无力症状。晚发型庞贝病的特点是病情进展较慢，主要影响骨骼肌。尽管酶替代疗法管理方面最近取得了进展，但使用这种治疗方法仍存在一些局限性，包括免疫原性并发症的风险、无法穿透中枢神经系统组织以及需要终生治疗。下一波有希望的单一疗法干预措施是基因疗法，它正在进入临床转化阶段。腺相关病毒 (AAV) 载体和慢病毒载体 (LV) 介导的造血干细胞和祖细胞 (HSPC) 基因治疗都有可能为这种多系统疾病提供有效的治疗。优化病毒载体设计，提供组织特异性表达和 GAA 蛋白修饰以增强分泌和摄取，已导致临床前疗效和安全性数据改善。在这篇综述中，我们重点介绍了基因治疗的发展，特别是 AAV 和 LV HSPC 介导的基因治疗技术，以潜在地解决神经肌肉相关庞贝病病理的所有组成部分。
标题：近乎完美的人类造血干细胞和祖细胞的精确靶向编辑
3 加拿大蒙特利尔大学细胞病理学和生物学系 摘要：对原代造血干细胞和祖细胞 (HSPC) 进行精确基因编辑将有助于单基因疾病的治愈性治疗以及疾病建模。然而，即使使用 CRISPR/Cas 系统，精确效率仍然有限。通过优化向导 RNA 递送、供体设计和添加剂，我们现在已经在原代脐带血 HSCP 上获得了 >90% 的平均精确编辑效率，同时毒性极小且未观察到脱靶编辑。实现如此高效率所需的主要协议修改是添加 DNA-PK 抑制剂 AZD7648，以及在供体中加入破坏间隔区的静默突变以及破坏 PAM 序列的突变。至关重要的是，编辑甚至跨越了祖细胞层级，没有显著扭曲层级或影响集落形成细胞测定中的谱系输出或高自我更新潜力长期培养起始细胞的频率。由于许多疾病的建模需要杂合性，我们还证明了可以通过添加突变体和野生型供体的特定混合物来调整整体编辑和杂合性。通过这些优化，现在可以在人类 HSPC 中直接以近乎完美的效率完成编辑。这将为治疗策略和疾病建模开辟新的途径。
使用CRISPRA和CRISPRI
使用核酸酶折叠的cas9融合到转录效应子分子的核酸酶，可以用CRISPR-CAS9系统（CRISPRA/CRISPRI）诱导靶向转录激活或干扰。这些技术已在癌细胞系中使用，特别是用于使用慢病毒载体的全基因组功能遗传筛选。但是，由于缺乏有效和无毒的递送方式，CRISPRA和CRISPRI尚未广泛应用于具有治疗相关性的离体培养的原代细胞。在这里，我们通过电穿孔基于RNA或核糖核蛋白（RNP）递送的CRISPRA和CRISPRI平台，并在原代细胞（包括人CD34 +血液 - 诗歌干和祖细胞和祖细胞（HSPC）和人CD3 + T细胞中显示短暂的，可编程的基因调节。我们使用来自不同细菌物种的多个SGRNA和CRISPR系统显示了多重和正交基因调制，并且我们表明CRISPRA可用于操纵HSPC的分化轨迹。这些平台构成了简单有效的手段，可以瞬时控制转录，并通过合成SGRNA轻松地采用并将其重新编程为新的靶基因。我们认为，这些技术将在工程中广泛使用用于干细胞生物学和基因功能的转录组，并且我们预计它们将被实施以开发和增强细胞疗法。