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DNA折纸铰链融合的自我修复水凝胶
Figure 1 – Schematic of wound healing in humans ........................................................ 3 Figure 2 – Schematic on DNA hairpin-based shape memory hydrogel............................ 5 Figure 3 – Schematics on how different studied self-healing systems work..................... 7 Figure 4 – DNA structure and the complementary base-pairing system ........................ 10 Figure 5 – Examples of DNA nanotechnology构造........................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................... 13图7 - 3D DNA折纸曲柄滑块结构.................................................to attach the DNA oligonucleotide crosslinks to the pAA chain ........................................................................................ 17 Figure 10 – Schematic illustrating how a free radical polymerization progresses........... 18 Figure 11 – DNA hairpin-dependent expansion of the pAA hydrogels in the 2017 study by Schulman et al................................................................................................................................................................................................................................................................................ 19图12 - PAA聚合反应的示意图............................................................................................................... 60分钟后的水凝胶形成.... 28图16 - 优化的PAA-SSDNA水凝胶............................................................................................................................................................................................... 29图17 - 对PAA凝胶优化的不同冷却设置的定性分析结果的结果.................................................................................................................................................................................................................................................................................反应混合物中存在的ssdna ................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................. 30
使用切口酶进行选择性线粒体 DNA 碱基编辑
线粒体内膜的物理和化学特性对常用于核基因组碱基编辑的CRISPR系统提出了挑战，因为其向导RNA不能轻易进入线粒体来编辑线粒体DNA（mtDNA）1。此外，之前鉴定的DNA脱氨酶主要针对单链DNA（ssDNA），这限制了它们在线粒体DNA碱基编辑器的开发中的应用。然而，可以修饰双链DNA（dsDNA）中胞嘧啶的DddA脱氨酶的发现，使得开发线粒体DNA碱基编辑器成为可能，例如DddA衍生的胞嘧啶碱基编辑器（DdCBE）和转录激活因子样效应物（TALE）连接的脱氨酶（TALED）2,3。这些工具依赖于 DddA，但受到其序列偏好以及通过与转录抑制因子 CTCF 4 相互作用对核基因组产生脱靶效应的风险的限制。此外，DdCBE 和 TALED 会编辑目标序列的两条链 2 , 3 ，从而导致不准确。这些限制阻碍了这些工具在研究和治疗由线粒体DNA突变引起的疾病中的应用。
rad51限制了重新激活起源的DNA过度复制
真核细胞依靠几种机制来确保在每个细胞分裂周期中精确地重复一次基因组，从而防止DNA过度复制和基因组不稳定性。这些机制中的大多数限制了来源许可蛋白的活性，以防止已经使用过的起源。在这里，我们研究了其他控制是否限制了在原点重新激活的情况下重新复制的DNA的扩展。在被迫重新激活起源的细胞中的遗传筛查中，我们发现重新复制受RAD51的限制，并被Rad51拮抗剂FBH1增强。在存在染色质的RAD51的情况下，由重型起源造成的叉子会减慢，从而导致叉子反转的频繁事件。最终通过PRIMPOL介导的DNA合成的重新定型会产生ssDNA间隙，从而促进通过MRE11核酸酶部分消除重复解复的DNA。在不存在RAD51的情况下，这些对照是一个因素，并且重新复制叉的进展时间比正常条件下的时间更长。我们的研究发现了在起源重新激活时保护基因组稳定性的保障机制。
COMPASS 亚基 Spp1 通过限制 DNA 对核酸酶的利用来保护 Tus/Ter 复制叉屏障处的新生 DNA
同源重组因子在 DNA 复制过程中对保护新生 DNA 起着至关重要的作用，但染色质在此过程中的作用尚不清楚。在这里，我们使用了已知可在酿酒酵母中诱导位点特异性复制叉停滞的细菌 Tus/Ter 屏障。我们报告称，Set1C 亚基 Spp1 被募集到停滞的复制叉后面，与其与 Set1 的相互作用无关。Spp1 染色质募集依赖于其 PHD 结构域与沉积在停滞叉后面的 H3K4me3 亲本组蛋白的相互作用。它的募集通过限制 Exo1 的访问来防止 ssDNA 在停滞叉处积累。我们进一步表明，删除 SPP 1 会增加屏障上游的突变率，有利于微缺失的积累。最后，我们报告称 Spp1 保护 Tus/Ter 停滞复制叉处的新生 DNA。我们认为 Spp1 限制了叉的重塑，最终限制了新生 DNA 对核酸酶的利用。
cas12b（A.酸性）重组
描述：重组A.酸性AAPCAS12B（V型CRISPR相关蛋白CAS12B），无标签。AAPCAS12B属于V型CRISPR效应器CRISPR-CAS12B/C2C1，对于广泛的应用，高温。物种：酸性酸性酸性构建体：CAS12B（全长）（酸性）浓度：0.20 mg/ml表达系统：大肠杆菌纯度：80％格式：水缓冲液溶液。以：50 mm磷酸钠，pH 7.5、300 mm NaCl，1 mM DTT和10％甘油MW：128 kDa GenBank登录：WP_067623834稳定性：至少在-80°C时至少6个月。存储：-80°C使用的说明：在冰上解冻，并在使用前轻轻混合。不要涡旋。在打开前进行快速旋转。等分的小容量，然后闪烁冻结以进行长期存储。避免多个冻结/解冻周期。测定条件：使用基于CRISPR的荧光记者测定法测量了不同量的AAPCAS12B活性，以获得最佳结果。使用RNA引导的DNA与CAS12结合，将靶DNA切割和不加选择的单链DNA侧支裂解激活。荧光信号的发射是由于裂解后ssDNA记者的降解所致。Active Cas12 was thawed on ice while 1X Endonuclease Buffer containing 10 mM Tris- HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl 2 , and 0.1 mg/ml BSA, guide RNA (custom designed crRNA), ds DNA activator (complementary sequence to crRNA and a PAM sequence specific for Cas enzyme) and FQ-ssDNA substrate （用荧光团和淬火器标记）平衡为室温。然后将板密封并在37°C下孵育10-30分钟。使用1X内核酸酶缓冲液制备了活性CAS12（4倍最终浓度）指南RNA（4倍最终浓度）和含有DS DNA激活剂和SSDNA报告基因（2倍最终浓度）的激活器/报告剂混合物（2倍最终浓度）。10 µL的4倍活性CAS12和10 µL的4倍引导RNA在室温下在固体黑色96井板的一半面积中预孵育10分钟。预孵育后，将20 µL的2倍激活剂/报告基因混合物添加到板上，并将其放置在振动孵化器上1分钟。然后将板平衡至室温，去除板密封剂，并在毫用读取器上读取荧光。阴性对照是通过用相等量的测定缓冲液代替酶工作溶液来测量的。应用程序：
辅酶A前体哑氨酸增强了肉瘤中的抗肿瘤免疫力
同源重组（HR）是双链断裂和封闭复制叉的DNA修复机制，涉及同源搜索过程，从而导致形成突触中间体，以确保基因组完整性。Rad51重组酶在该机制中起着核心作用，并由其RAD52和BRCA2伙伴支持。如果BRCA2在RPA-SSDNA上加载RAD51的介体功能很好地确定了Rad52在HR中的作用尚未了解。我们使用了与生物化学结合的透射电子显微镜来表征RPA，RAD52和BRCA2在RAD51纤维膜组装中的顺序参与及其活性。尽管我们的结果证实了RAD52缺乏介体活性，但Rad52可以与RPA涂层的sdNA紧密结合，抑制BRCA2的介体活性，并形成较短的Rad51-Rad52混合材料，这些混合源在突触综合体和D型较大的情况下更加有效，从而更加有效。我们确定了双链断诱导的体内后rad51和rad52之间的原位相互作用。这项研究提供了对人HR期间BRCA2和RAD52对突触前和突触中间体的形成和调节的新分子见解。
Bi-PE：双向引发改善 CRISPR/Cas9 ...
由Cas9切口酶和逆转录酶组成的Prime Editor能够对小片段DNA进行精准的靶向编辑，包括所有12种碱基替换、插入和删除，而不需要双链断裂或供体模板。目前优化的Prime Editor策略（PE3）使用两条引导RNA来引导Prime Editor的性能。一条同时携带间隔区和模板序列的引导RNA（pegRNA）引导Prime Editor产生ssDNA断裂和随后的延伸，另一条引导RNA在互补链上产生切口。在这里，我们证明将切口sgRNA定位在pegRNA的模板序列附近可以促进靶向的大片段删除，并且将两条引导RNA改造成pegR-NA以实现双向Prime Editor（Bi-PE）进一步将效率提高了16倍，编辑产物的准确性提高了60倍。此外，我们还发现 Bi-PE 策略提高了多碱基同时转换的效率，但单碱基转换的效率不如 PE3。总之，Bi-PE 策略扩大了 Prime 编辑系统的编辑范围，提高了编辑效率和准确性，具有广泛的潜在应用价值。
重组工程：利用同源重组进行细菌遗传工程”。引自：分子生物学最新协议
细菌染色体和细菌质粒可通过同源重组在体内进行改造，使用 PCR 产物和合成寡核苷酸作为底物。这是可能的，因为噬菌体编码的重组蛋白可以有效地重新组合同源序列，这些序列短至 35 到 50 个碱基。重组允许插入或删除 DNA 序列，而不考虑限制位点的位置。本单元首先描述了表达重组功能的电转化感受态细胞的制备及其用 dsDNA 或 ssDNA 的转化。然后，它介绍了支持协议，这些协议描述了几种两步选择/反选择方法，这些方法可以在不留下目标 DNA 中任何不必要的变化的情况下进行遗传改变，以及一种从大肠杆菌染色体或共电穿孔 DNA 片段中将遗传标记（通过检索进行克隆）检索到质粒上的方法。附加方案描述了筛选未选择突变的方法、从重组菌株中去除有缺陷的原噬菌体的方法和其他有用的技术。Curr. Protoc. Mol. Biol. 106:1.16.1-1.16.39。C 2014 by John Wiley & Sons, Inc.
levidys
背景升级（DeLandistrogene moxeparvovec-rokl）是重组基因治疗产物，由非复制，重组，腺相关病毒（AAV）血清型RH74（AAVRH74）（AAVRH74）capsid capsid和ssdna表达cassetter cassetter cassetter farank farank flank farank farank farank canverne cassever2 rank farank farank farank canverne cassever2。盒式盒包含：1）MHCK7基因调节成分，其中包括肌酸激酶7启动子和α-肌动蛋白重链增强剂，以及2）编码工程化的levetidys微型疾病蛋白（1）的DNA转基因。载体/capsid：临床和非临床研究表明骨骼肌细胞中的AAVRH74血清型转导。此外，在非临床研究中，在心脏和diaphragm肌肉细胞中已经证明了AAVRH74血清型转导（1）。启动子：MHCK7启动子/增强子驱动转基因表达，并已在动物模型中显示，以驱动转基因升降机微肌营养蛋白蛋白表达，主要在骨骼肌（包括diaphragragm）和心脏肌肉中。在临床研究中，肌肉活检分析已经证实了骨骼肌中的levidys微肌营养蛋白表达（1）。转基因：DMD是由DMD基因突变引起的，导致缺乏功能性肌营养不良蛋白。leviDys携带一个编码微肺炎蛋白的转基因，该蛋白由正常肌肉细胞中表达的肌营养不良蛋白的选定结构域组成（1）。
使用卷积子连续的多重噬菌体基因组编辑
170 171图1。临时性靶标基因组靶标基因组进行连续编辑a。 ICOMBIBRON示意图：A 172修饰的反龙生成ssDNA，该ssDNA包含供体序列，其与173个噬菌体基因组具有同源性的编辑序列，该基因组在SSB和SSAP复制过程中整合到噬菌体基因组中。RERON 174盒子是从包含逆转录酶（RT）和NCRNA的操纵子表达的。NCRNA的反向175个抄录区域以紫色显示为浅蓝色的供体序列，176编辑位点以橙色显示。第二个操纵子表示Csprect和mutl E32K。b。左：跨lambda噬菌体编辑的噬菌体177基因组（作为所有基因组的百分比）。用正向RT-DNA进行编辑以蓝色显示，紫色为178。在每个点的空心圆中显示三个单独的重复。右：使用179的编辑位点14,126（±SD）的重稳定物明显大于DRT对照的编辑（t检验，180 P = 0.0018）。c。左：在噬菌体T7上编辑的噬菌体基因组在每个位置进行了三个重复，在b中显示181。右：用现场22,872（±SD）的重稳定子进行编辑明显大于使用182 DRT对照的编辑（t检验，p = 0.0094）。d。左：在噬菌体T5上编辑的噬菌体基因组在每个183个位置上进行了三个重复，如b所示。右：用现场27,182（±SD）的重稳定子进行编辑显着高于使用DRT对照的编辑（t检验，p <0.0001）。e。位点30,840（f）（±SD）的Lambda的编辑与185张（±SD）与大肠杆菌SSB或T7 SSB的补充表达进行了比较。SSB 186表达（单向方差分析，p <0.0001，n = 3），大肠杆菌（p = 0.005）和T7（p = <0.0001）187均显着不同，与NO NO SSB条件显着不同（Dunnett's，校正）。f。与大肠杆菌SSB或T7 SSB的补充表达相比，位点11,160（R）188（±SD）的T7编辑。SSB表达（单向方差分析，p <0.0001，n = 3）具有显着的效应，大肠杆菌（P = 0.0002）和T7 190（p = 0.0127）均显着不同，与NO SSB条件显着不同（Dunnett's，更正）。g。示意图说明191编辑噬菌体的积累，并进行了多轮编辑。h。编辑的Lambda Phage的比例192