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OBM遗传学在...
使用基因靶向技术创建的抽象基因工程动物长期以来一直被认为是探索感兴趣基因功能的有益，有效和有价值的工具，至少至少在2013年初。然而，这种方法遭受了费力且耗时的任务，例如成功靶向胚胎干细胞（ES）细胞的产生，其表征，携带这些基因修饰ES细胞的嵌合胚泡的产生，以及将操纵囊肿的人移植到受体（Pseudopopeprepepregnant）的女性中，将其移植到chimericers中。由于基因组编辑技术的出现（现在是CRISPR/ CAS9系统的例证）在2013年底，通过基因组编辑成分的前核微介入（MI）在基因组编辑的动物的产生中取得了重大进展，将成分纳入受精的彩蛋（Zygotes）或Zygotes中的Zygotes中。但是，这些程序要求将基因组编辑的胚胎转移到受体女性的生殖道中，以进行进一步发展。通过卵形核酸递送（GONAD）及其修饰的版本（称为“改进的性腺（I-Gonad）”的基因组编辑是作为MI-EP或EP基因组基因组编辑的动物生产的一种替代方法，现在被认为是非常方便的基因组编辑，仅在vivo中表现出lum un lum curvical invi vivo。该系统还可以同时转染卵形腔内的上皮细胞。在这篇综述中，我们总结了性腺/ I -Gonad及其衍生物的最新进展，并讨论了这些技术研究与女性繁殖有关的各种生物系统的潜力。
最先进的 CRISPR 技术用于果蝇体内和细胞研究
一百多年来，果蝇（Drosophila melanogaster）一直是生物和生物医学研究的有力模型生物，因为它与人类有许多遗传和生理相似之处，并且可以使用复杂的技术来操纵其基因组和基因。果蝇研究界迅速采用了 CRISPR 技术，自首次在果蝇中发表成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 以来的 8 年里，他们探索并创新了诱变、精确基因组工程等方法。此外，由于寿命短和遗传学的便利性，果蝇成为体内应用和改进快速发展的 CRISPR 相关 (CRISPR-Cas) 工具的理想试验场。在这里，我们回顾了 CRISPR 试剂输送方面的创新、切割和同源定向修复 (HDR) 效率的提高以及标准 Cas9 方法的替代方案。虽然重点主要放在体内系统上，但我们也描述了果蝇培养细胞的作用，它既是评估新 CRISPR 技术过程中不可或缺的第一步，也是全基因组 CRISPR 池筛选的平台。
体内基因治疗肝脏和神经系统体内基因治疗肝脏和神经系统
体内基因工程最近显示出具有不断增长的疾病的新型有效治疗的巨大潜力，最近几种体内基因治疗产品的营销授权也见证了。体内基因工程既包括病毒载体介导的基因转移，也包括最近开发的基因组/表观基因组编辑策略，只要它们直接用于患者。在这里，我们首先回顾了商业可用或临床发育中最先进的体内基因疗法。然后，我们强调要克服的主要挑战，要全部和广泛利用体内基因疗法作为新药物，讨论了解决这些方法的一些方法，重点是将神经系统和肝脏作为范式实例。
MIC-Drop：大规模体内 CRISPR 筛选平台
CRISPR-Cas9 可以扩大规模，用于培养细胞的大规模筛选，但动物的 CRISPR 筛选一直具有挑战性，因为生成、验证和跟踪大量突变动物的成本过高。在这里，我们介绍了多重混合 CRISPR 液滴 (MIC-Drop)，这是一个结合液滴微流体、单针大规模 CRISPR 核糖核蛋白注射和 DNA 条形码的平台，可用于对斑马鱼进行大规模功能性基因筛选。该平台可以有效识别负责形态或行为表型的基因。在一个应用中，我们展示了 MIC-Drop 可以识别小分子靶标。此外，在对 188 个特征不明显的基因进行的 MIC-Drop 筛选中，我们发现了几个对心脏发育和功能很重要的基因。MIC-Drop 具有扩展到数千个基因的潜力，可在模型生物中进行基因组规模的反向遗传筛选。H
解锁 loxP 来追踪体内基因组编辑
摘要：CRISPR 相关蛋白（如 Cas9）的开发提高了基因组编辑的可及性和易用性。然而，需要额外的工具来量化和识别活体动物中成功的基因组编辑事件。我们开发了一种快速量化和监测活体动物中基因编辑活动的方法，该方法还有助于共聚焦显微镜和核苷酸水平分析。在这里，我们报告了一种新的 CRISPR“指纹识别”方法，用于激活小鼠中的荧光素酶和荧光蛋白作为基因编辑的功能。该系统基于我们之前的 cre 重组酶 (cre) 检测系统的经验，专为能够靶向 lox P 的 Cas 编辑器而设计，包括 SaCas9 和 ErCas12a 的 gRNA。这些 CRISPR 专门在 lox P 内切割，这种方法不同于以前靶向相邻终止序列的体内基因编辑活动检测技术。在这种传感器范例中，在肌肉或静脉内流体动力质粒注射后，在活体 cre 报告小鼠（FVB.129S6(B6)-Gt(ROSA)26Sortm1(Luc)Kael/J 和 Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J，本文中将称为 LSL-luciferase 和 mT/mG）中非侵入性地监测 CRISPR 活性，证明了其在两种不同器官系统中的实用性。通过共聚焦显微镜在特定组织的细胞水平上检查了相同的基因组编辑事件，以确定成功基因组编辑细胞的身份和频率。此外，SaCas9 诱导的靶向编辑效率与 cre 相当，证明了在整个动物中具有高效的传递和活性。这项研究建立了基因组编辑工具和模型，以非侵入性方式追踪体内 CRISPR 编辑并识别目标细胞。这种方法还使之前生成的数千种 lox P 动物模型中的任何一种都具有类似的实用性。
体内 CRISPR 筛选 mir- 的表型目标......
识别 miRNA 靶基因很困难，而确定哪些靶标在生物学上最重要则更加困难。我们设计了一种新策略，通过 CRISPR - Cas9 基因组编辑破坏秀丽隐杆线虫中每个预测的 miRNA 结合位点，来测试单个 microRNA - 靶标相互作用对表型的影响。我们开发了一种多重负选择筛选方法，其中对编辑的位点进行深度测序，并根据对破坏 miRNA 结合的突变的明显选择压力对候选位点进行优先排序。重要的是，我们的筛选是在突变动物体内进行的，这使我们能够研究生物体水平的表型。我们使用这种方法筛选了必需的 mir-35-42 家族的表型靶标。通过在所有预测靶标中生成 1130 个新的 3′UTR 等位基因，我们将 egl-1 确定为表型靶标，其去抑制部分表型复制了 mir-35-42 突变体表型，诱导了胚胎致死和低繁殖力。这些表型可以通过补偿性 CRISPR 突变来挽救，这些突变将 mir-35 重新定位到突变的 egl-1 3′UTR。这项研究表明，体内全生物体 CRISPR 筛选的应用具有加速发现非编码基因组中表型负调控元件的巨大潜力。
全基因组体内中枢神经系统筛查可识别出...
Mary H. Wertz，2、3 Mollie R. Mitchem，2、3 S. Sebastian Pineda，3、7、8 Lea J. Hachigian，1、2、3 Hyeseung Lee，2、3 Vanessa Lau，2、3 Alex Powers，2、3 Ruth Kulicke，2、3 Gurrein K. Madan，1 Medina Colic，4 Martine Therrien，2、3 Amanda Vernon，1、2、3 Victoria F. Beja-Glasser，1、3、5 Mudra Hegde，3 Fan Gao，2、6 Manolis Kellis，3、7 Traver Hart，4 John G. Doench，3 和 Myriam Heiman 1、2、3、9、* 1麻省理工学院脑与认知科学系，美国马萨诸塞州剑桥 02139 2 皮考尔学习与记忆研究所，美国马萨诸塞州剑桥 02139 3 麻省理工学院和哈佛大学布罗德研究所，美国马萨诸塞州剑桥 02142 4 德克萨斯大学 MD 安德森癌症中心，美国德克萨斯州休斯顿 77030 5 麻省理工学院麦戈文脑研究所，美国马萨诸塞州剑桥 02139 6 加州理工学院贝克曼研究所生物信息学资源中心，美国加利福尼亚州帕萨迪纳 91125 7 麻省理工学院计算机科学与人工智能实验室，美国马萨诸塞州剑桥 02139 8 麻省理工学院电气工程与计算机科学系，美国马萨诸塞州剑桥 02139 9 主要联系人 *通信地址：mheiman@mit.edu https://doi.org/10.1016/j.neuron.2020.01.004
利用专有脂质实现体内基因编辑...
• 小鼠品系：C57BL/6 和 ApoE KO • 剂量：1 mg/kg • Life Edit LNP • mRNA：fLuc + b-gal 组合 (1:1) • 时间点：静脉注射后 6 小时
光声造影剂在体内治疗方面的最新进展......
光声成像 (PAI) 是一种非侵入性混合成像方式，可提供丰富的光学对比度和高深度分辨率比的深层组织成像。体内存在的内源性发色团（如血红蛋白、脂质、黑色素等）由于在某些光学窗口具有强光吸收性而提供强大的光声对比度。为了进一步提高 PAI 的性能，研究人员开发了几种外源性造影剂，如金属纳米粒子、碳基纳米材料、量子点、有机小分子、半导体聚合物纳米粒子等。这些外源性造影剂不仅有助于提高成像对比度，而且还使靶向分子成像成为可能。在这篇评论文章中，我们首先讨论了具有内源性造影机制的最先进的 PAI 技术。然后，我们概述了用于体内成像应用的外源性光声造影剂的最新进展。最后，我们介绍了现有 PA 造影剂的优缺点以及基于造影剂的 PAI 在生物医学应用中的未来挑战。
基因组编辑器的体内靶向非病毒递送
RNA 引导的 CRISPR-Cas 酶因其功效、灵活性和易用性而被广泛用于基因组编辑 [已在其他地方进行综述 (1, 2)]。虽然 Cas9 等 CRISPR 蛋白已经在临床试验中显示出良好的前景，但对人类基因组造成永久性改变的现实意味着安全性至关重要。在基因组层面，Cas9 的特异性已通过预测脱靶位点的方法 (3, 4) 和分子工程来产生高保真度蛋白质 (5) 进行了优化。然而，一项将提高基因组编辑的实用性和安全性的关键发展是能够将 CRISPR-Cas 基因组编辑机制专门递送到患者体内所需的细胞类型、组织或器官。对于许多遗传疾病，只有一小部分细胞或特定器官表现出疾病的表型迹象，因此将成为基因组编辑的预期目标。对非预期细胞或器官进行基因组编辑可能会增加意外治疗结果的风险，此外还会因更高的剂量要求而增加制造成本。目前，CRISPR-Cas 基因组编辑器的靶向递送仍然是成功实现基因组编辑临床转化的重要未满足需求。病毒载体缺乏其天然基因组和复制能力，是基因治疗和最近的 CRISPR-Cas 基因组编辑的一种有吸引力的递送策略[在其他地方进行了综述 (6)]。最广泛使用的病毒载体是逆转录病毒和腺相关病毒 (AAV) (7, 8)。慢病毒载体是逆转录病毒的一个亚型，在基因组整合后表达较大的转基因 (~ 10 kb)，而 AAV 表达较小的转基因 (~ 4.7 kb)，来自长寿命的附加体；这两种病毒载体都能够转导分裂细胞和非分裂细胞。假型慢病毒载体 (9)、新 AAV 趋向性工程 (10) 和组织特异性启动子使用的进展使得这些技术能够实现细胞特异性递送。然而，病毒递送也引入了