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Cas12a 在解脂耶氏酵母中起指导作用
摘要 全基因组功能性遗传筛选已成功发现基因型-表型关系并设计新表型。虽然广泛应用于哺乳动物细胞系和大肠杆菌，但在非常规微生物中的使用受到限制，部分原因是无法准确设计此类物种的高活性 CRISPR 向导。在这里，我们开发了一种针对所选生物体（在本例中为产油酵母解脂耶氏酵母）的 sgRNA 设计实验计算方法。在不存在非同源末端连接（主要的 DNA 修复机制）的情况下进行负选择筛选，用于生成 SpCas9 和 LbCas12a 的单个向导 RNA (sgRNA) 活性谱。这种全基因组数据作为深度学习算法 DeepGuide 的输入，该算法能够准确预测向导活性。 DeepGuide 使用无监督学习来获取基因组的压缩表示，然后通过监督学习来映射具有指导活性的 sgRNA 序列、基因组背景和表观遗传特征。全基因组和选定基因子集的实验验证证实了 DeepGuide 能够准确预测高活性 sgRNA。DeepGuide 提供了一种生物体特异性的 CRISPR 指导活性预测因子，可广泛应用于真菌物种、原核生物和其他非常规生物。
使用 CRISPR 技术进行基因编辑
哺乳动物 CRISPR-Cas9 基因编辑系统利用 Cas9 使用 CRISPR 序列作为向导来识别和切割互补 DNA 链的能力。通过在哺乳动物细胞中表达 Cas9 核酸酶并引入针对目标基因的单个向导 RNA 序列 (sgRNA)，可以强制 Cas9 募集到目标 DNA 序列，从而将双链断裂引入基因组 DNA。在哺乳动物细胞中，这种双链断裂最常见的修复方法是非同源末端连接 (NHEJ)，这会导致切割位点删除或插入几个碱基对，通常导致移码和目标基因的功能失活。或者，同源重组 (HR) 系统可以参与修复，可以通过提供模板 DNA 来产生敲入突变或引入标签。
![梅克伦堡 [1923]](/simg/e\e681fc7c7289cd3aa878e509b74c0c7f2338e67e.png)
梅克伦堡 [1923]
“你是我们的向导、哲学家和朋友。”现在我们意识到我们不再是坐在教员脚下的学习者，我们开始欣赏日常交流的价值。起初，我们倾向于从其他来源寻求帮助，但随着岁月的流逝，我们开始了解并热爱我们的教员。我们开始感受到他们对我们的同情
集体能力在环境中的出现......
评审团前组成员： Blaise AGRESTI，高山向导、Mountain Path 创始人 Isabelle BOUTY，巴黎第九大学 PSL 大学教授 Frédérique CHEDOTEL，昂热大学大学教授 Anthony HUSSENOT，巴黎大学教授蔚蓝海岸
评论与观点 CRISPR–Cas9 gRNA ...
成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9) 系统已成为一种成功且有前途的基因编辑技术。为了促进其有效应用，已经开发了各种计算工具。这些工具可以通过预测切割效率和特异性并排除不良靶标来帮助研究人员进行向导 RNA (gRNA) 设计过程。然而，虽然有许多工具可用，但对其应用场景和性能基准的评估却有限。此外，最近已经探索了用于 gRNA 效率预测的新深度学习工具，但尚未进行系统评估。在这里，我们讨论了与靶标活性问题有关的方法，主要关注它们利用的特征和计算方法。此外，我们在独立数据集上评估了这些工具并给出了一些使用建议。最后，我们总结了 CRISPR-Cas9 向导设计未来方向的一些挑战和观点。
CRISPR-Cas9 弯曲和扭曲 DNA 来读取其序列
在细菌防御和基因组编辑应用中，CRISPR 相关蛋白 Cas9 搜索数百万个 DNA 碱基对，以定位与原型间隔区相邻基序 (PAM) 相邻的 20 个核苷酸、向导 RNA 互补的靶序列。靶标捕获需要 Cas9 使用未知的 ATP 独立机制在候选序列处解开 DNA。在这里，我们展示了 Cas9 在 PAM 结合时急剧弯曲和下扭转 DNA，从而将 DNA 核苷酸从双链体中翻转并转向向导 RNA 进行序列询问。在询问途径的不同状态下捕获的 Cas9:RNA:DNA 复合物的低温电子显微镜 (EM) 结构以及溶液构象探测表明，整体蛋白质重排伴随着未堆叠的 DNA 铰链的形成。弯曲诱导的碱基翻转解释了如何
来自致病空肠弯曲杆菌的无引导 Cas9......
CRISPR-Cas9 系统在人类致病菌中富集，并通过未知机制与细胞毒性相关。本文表明，空肠弯曲菌感染人类细胞后，会将其 Cas9 (CjeCas9) 核酸酶分泌到细胞质中。接下来，天然核定位信号使 CjeCas9 进入核，在那里它催化金属依赖性非特异性 DNA 切割，导致细胞死亡。与 CjeCas9 相比，化脓性链球菌的天然 Cas9 (SpyCas9) 更适合向导依赖性编辑。然而，在人类细胞中，天然 SpyCas9 仍可能造成一些 DNA 损伤，很可能是因为其 ssDNA 切割活性。这种副作用可以通过用适当的向导 RNA 饱和 SpyCas9 来完全预防，这对 CjeCas9 仅部分有效。我们得出结论，CjeCas9 在攻击人类细胞而不是病毒防御中发挥积极作用。此外，这些独特的催化特性可能使 CjeCas9 不太适合基因组编辑应用。
Lenti-X™ CRISPR/Cas9 系统用户手册
A. 摘要 CRISPR/Cas9 基因编辑技术彻底改变了基因组修饰领域，它使用两种关键成分形成复合物：Cas9 内切酶和引导 Cas9 到达基因组 DNA 中特定靶位的单向导 RNA (sgRNA)。Lenti-X CRISPR/Cas9 系统 (目录号 632629) 是一个完整的系统，可高产量地生产慢病毒，这些慢病毒编码了 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑所需的成分 [即单向导 RNA (sgRNA) 和 Cas9 核酸酶]，可递送至难以转染的哺乳动物细胞。该系统还包含必要的对照和足够的试剂，用于构建 10 种不同的靶 (sgRNA) 表达质粒。pLVX-hyg-sgRNA1 载体系统提供额外的线性化质粒、连接成分和 Stellar™ 感受态细胞。
构建 CRISPR-Cas9 活动教育材料纸质模型
• 使用 CRISPR 进行基因失活利用了非同源末端连接 (NHEJ)，这是细胞修复双链 DNA 断裂的主要修复过程。学生们可能想知道 CRISPR 如何利用这一过程引起突变。在 NHEJ 过程中，DNA 的断裂末端被连接在一起并重新连接。这个过程很容易出错，因为有时核苷酸会从断裂的末端丢失，并被细胞的修复机制错误地重新添加。如果 DNA 序列被 NHEJ 正确修复，Cas9 将使用向导 RNA 结合到序列上并再次切割 DNA。虽然细胞可以继续修复 DNA，但 Cas9 会继续切割它，直到细胞最终添加错误的核苷酸，这通常会导致基因失去功能。一旦 DNA 序列有错误的核苷酸，Cas9 将不再再次切割它，因为向导 RNA 将不再匹配和结合 DNA。
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