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正文 图 1 至 2 正文 我们怀着极大的兴趣阅读了 Zhou 等人的论文 1，其中描述了一种能够从极低输入（SILVER-Seq）进行细胞外 RNA 测序的新方法。与我们之前的研究 2,3 相比，检测到的基因数量之多令我们感到好奇，并且注意到可重复性较低。我们假设这两个观察结果都可能源于 DNA 污染。因此，我们重新分析了 SILVER-Seq 数据以确定测序读数中的 DNA 信号程度（方法见 https://github.com/jasperverwilt/SILVER-Seq_comment）。首先，我们分析了映射到不同基因组区域的读数分数。我们注意到这些分数与基因组中观察到的分布非常相似（图 1A）。具体而言，不到 5% 的读数映射到外显子区域，而我们自己的细胞外 RNA 测序数据 3 显示外显子读数平均为 35%。其次，我们分析了与剪接序列对应的读取，因为它们在 RNA 中预计相对丰富。然而，我们发现与剪接序列对应的读取仅占总唯一映射读取的 0.22%，而在我们自己的 RNA 测序数据中，它们占 17.8%，高出 81 倍（图 1B）。第三，我们从数据中生成了一名乳腺癌女性患者（SRR9094442）和一名健康男性对照（SRR9094547）的拷贝数谱。癌症患者的谱图显示出明显的拷贝数变化模式（例如 5、11 和 20 号染色体），这是使用无细胞 DNA 数据时通常发现的结果（图 2A）。关于男性对照的拷贝数谱，它显示出几乎完全平坦的拷贝数谱，X 和 Y 染色体的拷贝数水平为常染色体的一半（图 2B），这再次符合正常对照的无细胞 DNA 的预期。最后，SILVER-Seq 读数的链状性评估无法明确确认数据来自 RNA（图 1C）。这可能意味着文库制备方法没有保留片段的链方向（本文未指定的特征），或者数据主要来自 DNA。我们的重新分析提供了令人信服的证据，支持大多数 SILVER-Seq 数据来自 DNA，而不是细胞外 RNA。尽管作者进行了旨在防止此问题的 DNase 处理，但没有进行质量控制来验证其有效性。我们假设无细胞 DNA 的数量太高，或者血清中存在的抑制剂阻碍了有效的酶去除 DNA。此外，作者没有进行任何数据分析，专门评估其测序数据中是否存在 DNA 信号，例如本文报道的那些。重要的是，我们想强调的是，我们的观察结果不会削弱 SILVER-Seq 的潜在效用。这封信的目的是提醒大家当前
当 DNA 成为阻碍时
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