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根据全基因组关联研究 (GWAS)，许多基因位点与 2 型糖尿病患病率相关。其中，位于人类染色体 9P21.3 区域的 INK4 基因位点编码一个细胞周期依赖性激酶抑制剂家族（称为 p16 INK4a、p15 INK4b 和 p14 ARF），可抑制细胞周期依赖性激酶 CDK4 和 6。此外，一个名为 ANRIL 的非编码 RNA 位于该基因位点内，与其他三个基因相比，其转录方向相反（图 1 A）（Cunnington 等人，2010 年；Popov 和 Gil，2010 年）。重要的是，INK4 基因座含有六个与 T2D 相关的单核苷酸多态性 (SNP)，称为 rs2383208、rs10965250、rs10811661、rs10757283、rs1333051 和 rs7018475，位于 ANRIL 基因下游 8 kb 基因组区块 (INK4 T2D 风险区域) 中 (图 1 A) (Pasmant 等人，2010)。然而，这些 SNP 是否与 T2D 有因果关系以及它们如何调节 INK4 基因座尚不清楚。为了提供一种能够对 INK4 基因座的 T2D 关联 SNP 进行功能分析的工具，我们旨在生成缺少此 INK4 -T2D 风险区域的两个等位基因（纯合或双等位基因缺失）的 hiPSC 系。为此，我们使用我们最近建立的 hiPSC 系 (HMGUi001-A-1) (Wang et al., 2018) 通过 CRISPR/Cas9 基因组编辑系统进行基因靶向。由于靶向的是低保守性非编码 DNA，因此首先对 INK4 -T2D 风险区域上游（A 区域）和下游（B 区域）的 CRISPR 靶位点进行测序。然后，设计两组正向和反向引物（FA、RA；FB、RB）用于扩增 sgRNA 位点的边界区域（两个双链断裂）。接下来，设计具有高特异性得分的单向导RNA（sgRNA1和sgRNA2），并将其克隆到CRISPR表达载体中。通过Gibson组装克隆，我们生成了双sgRNA CRISPR/Cas9-GFP载体，
干细胞研究
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