我们使用过滤器 -1 和 -2 对原始 ReDeeM 数据进行了重新分析,结果表明这两个过滤器得出的结果大相径庭。两个过滤器之间的连接指标和由此产生的系统发育树存在很大差异,这一事实进一步证实了我们最初的担忧,即人工 mtDNA 变体(现在已被过滤器 -2 移除)仍然是所谓系统发育信号的重要驱动因素。反复提出的 k-NN 分析在设计上存在缺陷,不能被视为对 ReDeeM 方法的验证,也不能为人工变体的有效性提供支持。没有考虑影响单分子支持变体对克隆和系统发育推断的稳健性的其他混杂因素。作者认为,通过强调观察预期的 mtDNA 突变特征谱,仅由一个分子支持的变体仍然对系统发育推断具有参考价值。然而,我们对污染率的估计表明,环境 mtDNA 是 ReDeeM 方法的一个显著混杂因素。值得注意的是,污染率明显高于之前报道的 mtscATAC-seq 4,这需要进一步研究,但仅支持这样一种观点,即低分子拷贝数支持的 mtDNA 变体不应被视为系统发育推断。