犬类肠道微生物组是兽医和人类健康研究的关键模型，但由于方法上的变化而出现了不一致的发现。本研究提出了一个三部分的数据集，以阐明DNA提取，底漆选择和测序平台如何影响微生物分析。首先，我们使用五个DNA隔离试剂盒，多个库协议和四个测序平台（Illumina Miseq/Novaseq，Ont Minion，Pacbio Sequel IIE），启用16S RRNA和Shotgun测序技术的直接比较。第二，我们使用Zymo高分子量（ZHMW）和Zymo Magbead（ZMB）提取试剂盒分析了八只共同犬的40个粪便样品，以评估纵向提取效果。第三，我们使用合成模拟群落和人/犬粪便样品评估了三个16S引物系统（标准ONT，PACBIO，并用退化碱基修饰）来量化底漆偏见。通过整合合成和生物学重复，该数据集提供了标准化资源，用于基准生物信息学管道并改善跨研究可比性。该研究生成了75.3FGB的新测序数据：ZHMW- ZMB比较的43.45FGB，22.61FGB用于引物评估，而单样本分析中的9.19FGB。与先验数据的31.5FGB结合在一起，总数据集超过106FGB，包括所有分析输出。这些资源提高了不同实验室工作流程的犬类肠道微生物组研究的方法论透明度和准确性。