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确定可编程核酸酶的脱靶裂解谱是任何基因组编辑实验的重要考虑因素，并且已经报道了许多提高特异性的CAS9变体。我们在这里描述了基于标记的标签积分位点测序（TTISS），这是一种有效的，可扩展的方法，用于分析我们在59个目标中与八个CAS9变体平行应用的双链断裂。此外，我们生成了数千种其他CAS9变体，并筛选了具有增强特异性和活动的变体，识别LZ3 Cas9，这是具有唯一+1插入曲线的高特异性变体。这种全面的比较揭示了CAS9活动和特异性之间的一般权衡，并提供了有关+1插入频率的信息，这对校正移码突变具有影响。
CAS9变体特异性的高度平行分析
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