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LeishGEdit 引物设计流程为基因组中每个给定的 ORF 设计了总共六个引物序列，以实现 CRISPR-Cas9 基因编辑，从而允许用大量可用标签标记感兴趣基因的 N 端或 C 端，并删除 ORF 的两个等位基因（图 1B 和 C）。设计了两个 sgRNA 引物，一个靶向目标基因的 5'UTR，一个靶向 3'UTR。sgRNA 引物由 T7 RNAP 启动子序列、20 nt sgRNA 靶序列（用于在感兴趣的位点引入 DSB）和 20 nt 与 CRISPR-Cas9 主链序列的重叠组成，从而允许通过 PCR 生成 sgRNA 模板。需要一个包含整个 sgRNA 主链序列 [20] 的额外通用引物来扩增两个 sgRNA。四种引物专为 pPLOT 和 pT 质粒扩增而设计，可以以不同的组合使用 82 来产生供体 DNA。这些引物包括：上游正向引物 (#1)、83 上游反向引物 (#2)、下游正向引物 (#3) 和下游反向引物 (#4)。可以选择性地设计 84 额外引物，以允许使用从 pPOT 质粒模板扩增的供体 85 构建体进行 CRISPR-Cas9 介导的基因编辑 [21]。供体 DNA 引物包含紧邻 sgRNA 靶序列及其 PAM 位点的 30 nt HF 序列 86，以及与 pT、pPLOT 和 pPOT 质粒兼容的引物结合位点 87。虽然上游正向引物和下游 88 反向引物位置始终根据所选的 sgRNA 而变化，但上游反向引物 89 (#2) 和下游正向引物 (#4) 针对每个基因设计在相同的位置。90
1 LeishGEdit 工具箱的 Bar-seq 策略 2
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