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摘要 CRISPR/Cas9 系统可实现无疤痕、无标记的基因组编辑。目前，用于裂殖酵母 Schizosaccharomyces pombe 的 CRISPR/Cas9 系统依赖于繁琐且耗时的克隆程序，将特定的 sgRNA 靶序列引入 Cas9 表达质粒中。此外，据报道，当从强 adh1 启动子持续过表达 Cas9 核酸内切酶时，它会对裂殖酵母产生毒性。为了克服这些问题，我们开发了一种改进的系统 SpEDIT，它使用从中等强度 adh15 启动子表达的针对 S. pombe 进行密码子优化的合成 Cas9 序列。SpEDIT 系统表现出灵活的模块化设计，其中 sgRNA 与自切割丁型肝炎病毒 (HDV) 核酶的 3' 端融合，从而允许 tRNA 基因序列中的 RNA 聚合酶 III 驱动 sgRNA 盒的表达。最后，在 GFP 占位符两侧加入 Bsa I 型 IIS 限制酶位点，可实现 Golden Gate 介导的一步式 GFP 替换和合成的 sgRNA 表达。SpEDIT 系统通过转化异步培养细胞，在 ade6 + 或 ura4 + 基因中生成靶点突变体，可实现 100% 的诱变效率。SpEDIT 还允许以最小的努力获得插入、标记和删除事件。还可以轻松实现两个独立非同源基因位点的同时编辑。重要的是，与目前可用的 S. pombe 编辑系统相比，SpEDIT 系统显示出更低的毒性。因此，SpEDIT 提供了一种有效且用户友好的 CRISPR/Cas9 程序，可显著改善裂殖酵母的基因组编辑工具箱。
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